細胞が産生する活性酸素の新しい高感度測定系の開発

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研究代表者らが独自に研究、開発した過酸化水素の超高感度吸光分析試薬であるOxo[5,10,15,20-tetra(4-pyridyl)porphyrinato]titanium(IV)(Ti-TPyP)試薬と、フローインジェクション分析法(FIA)を組み合わせることにより、マクロファージなどの食細胞が刺激に応じて細胞外へ放出する活性酸素の、新しい高感度測定法の構築に成功した。TiTPyP試薬と過酸化水素の反応は、細胞培養液中に存在する各種金属イオン、タンパク質、アミノ酸、グルコースなどの共存物質の影響を受ける事なく安定であった。そこで、細胞が産生する極微量の過酸化水素を、より高感度に、且つ迅速に定量するためTi-TPyP試薬を用いたFIAの確立を試みた。流路に流すTi-TPyP試薬の濃度や流速、反応槽の長さ、反応温度などの指摘条件を詳細に検討した結果、過酸化水素0.5pmole-2000pmole/testの範囲で相関係数0.999以上の検量線が得られるFIAの構築に成功し、一時間に30検体の測定が可能となった。次に本FIAを、予め刺激を与えて活性化させたマクロファージから放出される過酸化水素の測定に応用したところ、良好な定量性が得られ、活性化マクロファージが1000個以上あれば過酸化水素が検出可能であった。これは従来法の約100倍の感度であった。更に本FIAは細胞内catalase活性の測定(20mU/test以上で検出可能)や、炎症性疾患時のヒト肺胞洗浄液中の活性酸素の検出にも応用可能であった(炎症性疾患時のヒト肺胞洗浄液から実際に過酸化水素の存在が確認されたのは他に例がない)。以上、本FIAは細胞の活性酸素産生能やcatalase活性を、僅かな試料で精度良く、且つ迅速に測定できる有用な方法であることが確認された(現在投稿論文作製中)。