アルコールをケトン体へ酸化する新規P450のcDNAクローニングと反応機構解析

新型乙醇氧化酮体P450的cDNA克隆及反应机理分析

• 批准号: 07772193
• 负责人: 松永 民秀
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Hokuriku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772193/
• 关键词: Microsomal Alcohol Oxygenase; 7-OH-Δ^8-THC; 7-oxo-Δ^8-THC; 第2級アルコール; ケトン; P450; サル; マウス

当研究室において、Δ^8-tetrahydrocannabinol(Δ^8-THC)の代謝物である7-OH-Δ^8-THC(第2級アルコール)が、分子状酸素とNADPHを必要とするミクロソーム中の酵素により、7-oxo-Δ^8-THC(ケトン体)に酸化されることを見い出した。さらに、このような反応を触媒する酵素をMicrosomal Alcohol Oxygenase(MALCO)と命名、その高い活性を有するモルモット肝ミクロソームより、主要な酵素として3A subfamilyに属すると推定される新規なP450(P450GPF-B)を精製した。そこで、本研究においてはモルモット以外の動物種について同様に明らかにすると共に、先にcDNAをクローニングしたMicrosomal Aldehyde Oxygenase(MALDO)と比較、それらの性質及び構造を明らかにすることを目的として検討を行った。その結果、マウス及びサル肝のHALCO活性も抗P450G PH-B抗体により顕著に阻害された。また、マウスのHALCO_2活性は、デキサメサゾン及びフェノバルビタール処理により有意に誘導された。そこで、デキサメサゾン処理マウス及び未処理ニホンザルの各肝ミクロソームより、抗P450GPF-B抗体との交差性を指標に精製し、その主要な酵素としてP450MDX-B及びP450JM-Eを得た。これらP450の酵素化学的性質及びN末端アミノ酸配列の比較より、いずれも3A subfamilyに属するP450であることが示唆された。また、^<18>O_2気相下ミクロソーム系による7-oxo-Δ^8-THCへの^<18>Oの取り込みに、光学異性体である7α-と7β-OH-Δ^8-THCでは明らかな違いが認められることから、複数の分子種の寄与があるものと考えていた。しかし、両精製酵素を用いた再構成系においても7α-OH-Δ^8-THCを基質とした場合には7-oxo-Δ^8-THCへの^<18>Oの取り込みが認められたのに対し、7β-OH-Δ^8-THCではほとんど取り込まれなかったことから、1つの分子種が立体選択的な機構により酸化することが示唆された。また、マウスのcDNAライブラリーよりP450MDX-Bと推定されるcDNAをクローニングし、その一次構造を決定した。その結果、本P450は3A subfamilyに属する分子種であると共に、HALDの主要な酵素であるCYP2との相同性は低いことが明らかとなった。

When the laboratory is in the middle, the metabolite of Δ ^8-tetrahydrocannabinol (Δ ^8-THC) is 7-OH-Δ ^8-THC (second order), and the molecular acid and NADPH are necessary for the acidification of enzymes in the system. Microsomal Alcohol Oxygenase (MALCO) is a new enzyme that has been identified as a member of the 3A subfamily. In this study, we compared the properties and structures of MALDO with those of other animal species. The results showed that the HALCO activity of Mars and Serra liver was significantly inhibited by anti-P450G PH-B antibodies. HALCO_2 activity is intentionally induced by a variety of factors. The main enzymes of P450 MDX-B and P450 JM-E were purified from the serum of P450 GPF-B and P450 JM-E. Comparison of enzyme chemical properties and N-terminal amino acid sequences of P450 in the 3A subfamily In the case of the optical isomer 7 α-7 β-OH-Δ ^8-THC, the molecular species of the complex molecule are identified in the light and light phases of 7-oxo-Δ ^8-THC.<18><18>In the case of 7 α-OH-Δ ^8-THC as substrate, 7 β-OH-Δ ^8-THC as substrate, and 1 β-OH-Δ ^8-THC as substrate.<18>P450MDX-B is a putative cDNA fragment, and its primary structure is determined. As a result, this P450 is a member of the 3A subfamily, and its major enzymes are CYP2.

项目成果

T. Matsunaga: "Microsomal Aldehyde Oxygenase(MALDO): Purification and Characterization of A Cytochrome P450 Isozyme Responsible for Oxdation of 9-AA to 9-ACA in Monkey Liver" J. Biochem.119(in Press). (1996)

T. Matsunaga：“微粒体醛加氧酶 (MALDO)：负责猴肝脏中 9-AA 氧化为 9-ACA 的细胞色素 P450 同工酶的纯化和表征”J. Biochem.119（出版中）。