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放線菌とバチルス属細菌に共通する二次代謝系の糖質変換酵素反応と遺伝子の解析

放线菌和芽孢杆菌常见的次级代谢系统中碳水化合物转化酶反应和基因分析

基本信息

批准号：
07780491
负责人：
山内敬明
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1 Streptomyces fradiaeより得られた2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素に関し、部分精製酵素を用いた実験で、これまで基質グルコース-6ーリン酸の4位でNAD依存性の酸化還元が酵素反応の間に起こることを示唆する結果を得ていた。その詳細を探るため、酸素同位体と重水素を同一分子中に標識した基質を用い、これと非標識基質を混在化させて酵素反応を行い、生成物の標識のクロスオーバーの有無を追跡した。[4-^2H,3-^<18>O]グルコースを新規に合成し、これを用いて二重標識体を非標識体と7:3の割合で混在させNAD共存化で酵素反応を行い、生成物を誘導体化後、質量分析したところ標識のクロスオーバーは観測されず、また約2.7の同位体効果が観測された。これは本酵素が多段階の反応を触媒する単一酵素であることを強く示唆する。本結果をもとめJ.Org.Chem.に報告した。酵素の精製は現在検討中であるが、NAD類似構造を持つ色素をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーが有効であることがわかった。しかし一方で安定性の問題がクリアできていない。2 唯一バチルス属の菌として2-デオキシストレプタミンを含む抗生物質ブチロシンを生産するBacillus circulansについて"2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素"の活性が存在するか追跡を行った。Bacillus circulansのブチロシン生産株より無細胞系を調製し、硫安分画を行ったところ、45〜70%飽和硫安濃度で沈殿するタンパク質画分に活性を確認した。酵素はイオン交換クロマトグラフィーを行い、反応機構の解明を行えるレベルに精製ができ、現在二重標識基質の実験を行っている。またその後、色素をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーが極めて有効であることなどがわかり、酵素はHPLCでの精製段階に入っている。

1. Streptomyces fradiae was identified as a 2-decyl-scyllo-2-synthase enzyme, a partially purified enzyme, and a substrate at the 4-position of the 6-decyl-amino acid, an NAD-dependent acidifying enzyme, and an enzyme reaction. In the same molecule, the labeled substrate is used, and the labeled substrate is mixed in the enzyme reaction, and the labeled substrate of the product is traced. [4-2H, 3-<18>O]- The enzyme is a multi-stage enzyme. This report was prepared by J. Org. Chem. The enzyme is refined in the present study, and the NAD similar structure holds the pigment. The problem of stability of a party is not solved. 2. The activity of Bacillus circulans in the production of 2-DSCYLO-DSCYLO-DSCYLODSCYLO-DSC Bacillus circulans production strains without cell line modulation, sulfur content, 45 ~ 70% saturation sulfur content, precipitation of sulfur content, activity confirmed The enzyme exchange mechanism, the reaction mechanism, the purification mechanism, the present double labeling matrix, the present double labeling mechanism. After the pigment is removed, the pigment is removed and the enzyme HPLC is purified.