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アミノグリコシド系抗生物質アグリコンの炭素環合成酵素の精製と反応機構解析

氨基糖苷类抗生素苷元碳环合酶的纯化及反应机理分析

基本信息

批准号：
05780415
负责人：
山内敬明
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

当初の計画に基づきネオマイシン生産菌Streptomyces fradiae菌体より調製した無細胞抽出液について、硫安分画、DEAEイオン交換クロマトグラフィーを行い、"2-deoxy-scyllo-inosose合成酵素"を部分精製した。さらにこの反応機構の考察に重要な基質グルコース-6-リン酸の4位水素の挙動を追跡した。4位重水素化基質およびpositive controlとして6位重水素化基質を化学的に合成した後、本反応の補酵素であるNADとともこれら基質を上記部分精製酵素液に加えインキュベーションを行い、生成物を誘導体化後^2HNMR測定および質量分析した。その結果、基質の4位重水素は、反応生成物である2-deoxy-scyllo-inososeの6位に約60%が保持されていることが明らかとなった。さらにこの間に重水素に関する同位体効果に由来すると思われる化学収率の低下が見られた。これは、本反応では基質4位において補酵素の触媒的回転により酸化還元反応が起こることを示し、本反応が単一酵素による可能性を示唆するものと考えられる。本酵素反応は微生物や植物の芳香族アミノ酸生合成系、シキミ酸経路中でのデヒドロキナ酸合成酵素の反応と類似性が示唆されているが、本研究で得られた結果(補酵素の触媒的回転による酸化還元)はデヒドロキナ酸合成酵素でも既に報告されており、本酵素とデヒドロキナ酸合成酵素の類似性を示すものであると考えられる。今後この現象を定量的に解釈するため、そして本酵素の構造と性質を調べ、酵素レベルでこれら二つの反応系を比較検討し、一次代謝と二次代謝の比較により二次代謝の起源と発現機構を明らかにすることを目的とし、現在酵素反応の最適条件、および各種クロマトグラフィーによる本酵素の精製を検討している。また本反応系はグルコースをはじめとする糖誘導体より光学活性サイクリトールを生産する新たな物質変換系を構築できる可能性を秘めており、この点に関し、各種糖誘導体を用い基質特異性を検討することについても計画している。

In the original project, the cell-free extract of Streptomyces fradiae was prepared and partially purified by "2-deoxy-scyllo-inose-synthase". In addition, during the inspection of this anti-terrorism agency, the movement of the 4-position water element of the important substrate coloco-6-rinic acid was tracked. 4-position heavy amino acid substrate is chemically synthesized, the enzyme is partially purified, and the product is induced by 2H NMR. As a result, about 60% of the 6-position of the 2-deoxy-scyllo-inoose in the matrix was retained. The reason for this is that the chemical yield is low. The enzyme in the 4-position of the substrate is the enzyme in the 4-position of the substrate, and the enzyme in the 4-position of the substrate is the enzyme in the 4-position of the substrate. This enzyme has been reported to be related to the similarity of enzymes in microbial and plant aromatic acid biosynthetic systems and enzymes in the acid pathway. The results of this study were as follows: In the future, the structure and properties of the enzyme will be adjusted, and the enzyme will be compared with the reaction system of the primary metabolism and the secondary metabolism. The present system of sugar inducers has the potential to construct new substance exchange systems, such as the use of sugar inducers, the specificity of substrates, and the possibility of producing sugar inducers.