グルクロン酸転移酵素遺伝子複合体における発現制御と分子多様性の解析

葡萄糖醛酸基转移酶基因复合物的表达调控和分子多样性分析

• 批准号: 07780545
• 负责人: 衣斐 義一
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780545/
• 关键词: グルクロン酸転移酵素; 薬物代謝; 初代培養肝細胞; 遺伝子発現制御; Ahレセプター; 薬物応答エレメント; 化学発ガン物質

本研究では、グルクロン酸転移酵素ファミリー1(UGT1)に属しメチルコラントレン(MC)-誘導型分子種であるUGT1A1のラット肝細胞における遺伝子発現を制御する機構について解析し、当該年度において以下に示す事を明らかにした。1.UGT1A1遺伝子のプロモーター領域の構造塩基配列を解析した結果、転写開始点より上流29塩基から24塩基の間にTATA boxが同定せれ、また134塩基から129塩基にかけてMCによる転写活性化に必要な薬物応答エレメント(XRE)が同定された。またこれら以外にも、314塩基から302塩基および251塩基から236塩基の二箇所に肝特異的発現に関わるHNF-4認識配列などが同定された。2.XREの機能解析(1)CATアッセイによる機能解析:UGT1A1遺伝子のプロモーター領域約1.1kbを含むDNA断片を上流側から段階的に決失させ、CATレポーター遺伝子と連結した融合遺伝子を作製した。これらをラット肝初代培養細胞に導入してMCによる発現誘導を調べた結果、XREを欠く融合遺伝子はMCに応答しなくなる事が分った。また部位特異的変異導入法により、XREを欠失あるいはその塩基を置換した場合もMCへの応答が消失した。(2)ゲルシフトアッセイによるAhレセプターとXREの結合の解析:UGT1A1のXREを含む合成オリゴヌクレオチドをプローブとし、肝細胞の核抽出液を用いてゲルシフトアッセイを行った。この結果、MCで処理した細胞の核のみにXREと結合するタンパク質が現れ、このタンパク質がリガンド結合型のAhレセプターである事を示した。またXREに変異を導入したものではAhレセプターとの結合が消失する事を示した。(3)DNase Iフットプリント法による結合部位の同定:UGT1A1のXREを含む合成オリゴヌクレオチドをプローブとし、肝細胞の核抽出液を用いてDNase Iフットプリントを行った。その結果、XREの部分がDNase Iによる消化から保護されておりXREにAhレセプターが結合する事を示した。3.まとめUGT1A1遺伝子の転写はプロモーター領域のXREを介してAhレセプターにより活性化される。

In this study, we analyzed the mechanisms for the regulation of gene expression in liver cells of UGT 1A1, a member of the group consisting of UGT 1 (MC)-inducible molecular species, and clarified the following at the end of the year. 1. The structure of UGT1A1 gene was analyzed based on the structure of UGT1A1 gene, and the TATA box was determined based on the structure of UGT1A1 gene. The TATA box was determined based on the structure of UGT1A1 gene. The HNF-4 recognizes the identity of the two liver-specific occurrences associated with the 314-base, 302-base, and 251-base. 2. Functional analysis of XRE (1) CAT analysis: UGT 1A1 gene domain is about 1.1 kb, including DNA fragments, upstream segment detection, CAT analysis, gene linkage, fusion gene control. The results of induction and fusion of XRE in primary cultured liver cells were analyzed. In case of site-specific introduction, XRE is missing, MC is missing. (2)Analysis of the combination of UGT 1A1 and XRE: UGT 1A1 and XRE are composed of UGT 1A1 and UGT 1A1. The results of this study show that MC treatment can be used to treat the nuclear XRE binding of cells. The difference between the two is that the two are different. (3) Identification of binding sites by DNase I protein extraction method: UGT 1A1 and XRE were synthesized by DNase I protein extraction method. As a result, XRE is partially digested and protected by DNase I. 3. UGT 1A 1 gene is activated by XRE in the field.