初代培養肝細胞で発現が誘導されるグルクロン酸転移酵素

在原代培养的肝细胞中诱导表达的葡萄糖醛酸基转移酶

• 批准号: 08780595
• 负责人: 衣斐 義一
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780595/
• 关键词: UDP-グルクロン酸転移酵素; 初代培養肝細胞; 遺伝子発現; ビリルビン; 薬物代謝

1. UDP-グルクロン酸転移酵素のメチルコラントレンによる転写活性化機構 ラット肝初代培養細胞にレポーター遺伝子を導入することによりメチルコラントレンで誘導されるUDP-グルクロン酸転移酵素(UGT1A6)の転写活性化機構を解析した結果、UGT1A6遺伝子の転写開始点から上流135塩基前後に薬物応答配列(GCGTG)が同定された。さらに、ゲルシフトアッセイおよびフットプリントアッセイの結果、ここにAhレセプター/Arnt複合体が結合することが判明した。2.初代培養肝細胞で誘導されるUDP-グルクロン酸転移酵素 (1)各UGT1分子種に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行った結果、ラット肝ではほとんど発現しないUGT1A3が肝初代培養細胞で大幅に(約100倍)誘導されていることが分った。(2)UGT1A3遺伝子のプロモーター領域をpBluescript IIにサブクローニングしてexonuclease IIIにより段階的に欠失させた鋳型を調製し、およそ4.8kbの塩基配列を解析した。(3)得られた塩基配列からTFSEARCHプログラムにより転写調節因子の認識部位候補を検索した結果、GATA配列、HNF、USF、およびTATAボックスなどが同定された。今後はシークエンス反応の鋳型に用いた欠失体を元にCATレポーター遺伝子を作製し、UGT1A6のときと同様な手段により転写活性化に必要な領域を決定する方針である。(4)ビリルビン代謝型分子種であるUGT1A1、UGT1A2、UGT1A3、およびUGT1A5、さらにフェノール代謝型分子種であるUGT1A6のcDNAを発現ベクターpUCDSRαに連結し、これらをCOS細胞に導入して各分子種を一過的に発現させた。その結果、UGT1A1およびUGT1A6はそれぞれビリルビンおよび4-ニトロフェノールを基質としたグルクロン酸抱合活性を示したが、UGT1A3はどちらに対しても活性を持たなかった。またUGT1A3は、4-メチルウンベリフェロンおよびジギトキシンモノジギトキシドに対してもグルクロン酸抱合活性を示さなかった。

1. UDP-グ ロ ロ ロ ロ acid 転 pipette メチ メチ コラ コラ トレ トレ による転 による転 write the activation mechanism ラ ッ ト liver early generation of cultured cells に レ ポ ー タ ー posthumous son 伝 を import す る こ と に よ り メ チ ル コ ラ ン ト レ ン で induced さ れ る UDP - グ ル ク ロ ン acid (UGT1A6) planning shift enzyme の planning agencies を analytical writing activity し た results, UGT1A6 but 伝 の planning write starting point か ら に before and after the upper 135 salt base 薬 応 answer match column (GCGT G)が is the same as された. さ ら に, ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ お よ び フ ッ ト プ リ ン ト ア ッ セ イ の results, こ こ に Ah レ セ プ タ ー / Arnt complex が combining す る こ と が.at し た. 2. The first-generation cultured hepatocytes で induce される UDp-グ ロ ロ <s:1> acid 転 transferase (1) each kind of に UGT1 molecules specific な プ ラ イ マ ー を with い を line っ て RT - PCR た results, ラ ッ ト liver で は ほ と ん ど 発 now し な い UGT1A3 が liver early generation of cultured cells で に significantly (about 100 times) induced さ れ て い る こ と が points っ た. (2) UGT1A3 posthumous son 伝 の プ ロ モ ー タ ー field を pBluescript II に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し て exonuclease III に よ り Duan Jie に owe lost さ せ た where を し modulation, お よ そ 4.8 KB の salt base with column を parsing し た. (3) ら れ た salt base with column か ら TFSEARCH プ ロ グ ラ ム に よ り planning write adjustment factor の know parts of alternate を 検 cable し た results, GATA column, HNF, is, お よ び TATA ボ ッ ク ス な ど が with fixed さ れ た. Future は シ ー ク エ ン ス anti 応 の type where に with い た owe RMB lose body を に CAT レ ポ ー タ ー heritage を son 伝 し, UGT1A6 の と き と with others means な に よ り planning write activeness に な necessary field を decided す る policy で あ る. (4) ビ リ ル ビ ン metabolic type molecules of で あ る UGT1A1, UGT1A2, UGT1A3, お よ び UGT1A5, さ ら に フ ェ ノ ー ル metabolic type molecules of で あ る UGT1A6 の cDNA を 発 now ベ ク タ ー pUCDSR alpha に link し, こ れ ら を COS cell に import し て of molecules each kind of を に 発 now Youdaoplaceholder0. そ の results, UGT1A1 お よ び UGT1A6 は そ れ ぞ れ ビ リ ル ビ ン お よ び 4 - ニ ト ロ フ ェ ノ ー ル を matrix と し た グ ル ク ロ ン acid を looping activity in し た が, UGT1A3 は ど ち ら に し seaborne て も active を hold た な か っ た. ま た UGT1A3 は, 4 - メ チ ル ウ ン ベ リ フ ェ ロ ン お よ び ジ ギ ト キ シ ン モ ノ ジ ギ ト キ シ ド に し seaborne て も グ ル ク ロ ン acid を looping activity in さ な か っ た.

项目成果

T. Iyanagi: "Gene organization and genetic defects of bilirubin UDP-glucuronosyltransferase" Oxygen Homeostasis and Its Dynamics. (印刷中). (1997)

T. Iyanagi：“胆红素 UDP-葡萄糖醛酸基转移酶的基因组织和遗传缺陷”氧稳态及其动力学（出版中）。