大腸菌染色体複製の開始制御の分子機構:開始因子DnaAタンパク質の機能制御機構

大肠杆菌染色体复制起始控制的分子机制：起始因子DnaA蛋白的功能控制机制

• 批准号: 07780603
• 负责人: 片山 勉
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780603/
• 关键词: DNA複製; 染色体; 細胞周期; 生化学; 分子生物学; 分子遺伝学; 複製開始; 原核生物

本研究は、大腸菌における染色体複製の制御機構の解明をめざし、複製開始タンパク質DnaAの活性制御因子を探索し同定することが目的であった。目的とした因子はDnaAタンパク質を特異的に認識して不活性化するタンパク性因子であり、研究代表者が独自に見いだしたものである(Katayama、T.、and Crooke、E.(1995)J.Biol.Chem.270、9265-9271)。この因子によって不活性化されたDnaAタンパク質は、ミニ染色体の試験管内複製反応に対する活性を失っている。目的の因子を精製して同定するため、まず大腸菌の大量培養を行った。次に、DnaAタンパク質の不活性化を指標に、種々の分画法を試みた。最終的に分画に用いた手法は、1.硫安沈殿、2.DE52(Whatman)、3.ヒドロキシアパタイト、4.FPLC mono-Q、5.FPLC superdex200、6.FPLC mono-Pであった。最終分画の段階において、DnaAタンパク質の不活性化と挙動を共にするタンパク性因子を認めることができた。この因子の実体を明らかにするため、自動エドマン分解法によるアミノ酸配列決定を行ったところ、N-末端3残基を明らかにすることができた。現在、さらに多くのアミノ酸配列を知るため、大量精製を行っている。また、本研究を滞りなく進行させるためには、DnaAタンパク質の安定供給体制の確立も重要であった。かつてはDnaAタンパク質は精製が難しくため収量が低く、これが生化学的研究の足かせとなっていた。研究代表者はまず、DnaAタンパク質の大量発現系に根本的な改良を加え、菌体全タンパク質の約15%までDnaAタンパク質が蓄積する系を新たに確立した。さらに精製法にも改良工夫を加え、50gの菌体から10mgのDnaAタンパク質を精製できる実験系を見いだした(未発表)。

The aim of this study was to elucidate the mechanism of chromosome replication control in E. coli and to explore the mechanism of replication initiation and regulation of DNA activity. Objective: To study the characteristics of DnaA and DnaA, and to study the characteristics of DnaA and DnaA and DnaA. and Crooke、E. (1995)J.Biol.Chem.270、9265-9271)。This factor is inactivated by DnaA sequencing and DnaA sequencing. Objective: To purify and stabilize the factors and culture Escherichia coli in large quantities. Second, DNA-based qualitative inactivation index, seed analysis method to try The final sub-painting methods are: 1. sulfur and sulfur, 2. DE52 (Whatman), 3., 4. FPLC mono-Q, 5. FPLC superdex200, 6. FPLC mono-P. Finally, the classification of the stage, DnaA, quality and inactivation of the common factors, such as the identification of the quality factor. The sequence of these factors is determined by the automatic decomposition of the N-terminal residues. Now, we have a lot of acid matching, a lot of refining. This study is important to establish a stable supply system for quality control. It is difficult to refine the quality of the product, and it is difficult to refine the quantity of the product. The research representative pointed out that a large number of DNA-containing substances were found in the basic improvement system, and about 15% of the total DNA-containing substances were found in the new system. In addition, the purification method was improved by adding time, 50g of bacteria, 10mg of DnaA, and the purification system was improved (not shown).