受容体より、アダプター分子Shcを介する増殖及びアポトーシスシグナル伝達の解析

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本年度の大きな成果のひとつは、Shcの主要なチロシンリン酸化部位として、Grb2結合部位であるY317の他に、Grb2と結合しないY239/240を新たに同定し、Ras-independentなShe-Myc pathwayが、この部位のリン酸化から発することを明らかとしたことである。Shc-Myc pathwayは未知のシグナル伝達系であり、さらに解明していくことが今後の課題である。1 IL-3によるアポトーシス抑制シグナル伝達Shcのチロシンリン酸化部位の変異体をBa/F3細胞に発現させた。She-Ras pathwayをなくしたY317F Shc発現細胞は、アポトーシス抵抗性であったが、Y239/240F Shc発現細胞は、c-myc mRNAが減少し、アポトーシスに陥りやすかった。アポトーシスの抑制には、Y239/240-myc pathwayが重要であった。このpathwayの下流として、bcl family, ICE family, P53等の発現について、さらに詳細な検討を加えたい。2. EGFによる細胞増殖シグナル伝達(1)免疫沈降したEGF-Rによって、GST-Shcをin vitroでリン酸化させたのち、二次元tryptic mappingを行い、Shcの主要なチロシンリン酸化部位として、新たにY239/240を同定し、in vivoでも同様にリン酸化されることを確認した。(2) Shc変異体をEGR-R高発現細胞へ発現させた。Y317F ShcまたY239/240F She発現細胞は、EGFによる増殖刺激を抑制しなかった一方、Y239/240/317F Shc発現細胞は、抑制した。EGFによる増殖シグナル上では、Shc-Ras pathwayとShc-Myc pathwayが、相補的に関与していることを示唆した。3. Shc下流因子のクローニングEGF-Rの自己リン酸化部位を欠失したcDNAとShcのチロシンリン酸化部位を含むcDNA断片とをつないだキメラcDNAを作製し、バクロウイルス発現系により、大量に発現させ、精製した。これを[32P]-γATPを用いて高い比活性でチロシンリン酸化させ、ヒト胎盤より作ったλgt11発現ライブラリーをwest-western法によりスクリーニングし、ポジティブクローンを得ている。これらの核酸配列を決定し、全長cDNAをクローニングし、Shc-Myc pathwayを直接つなぐ分子としての可能性を含め、詳細に解析したい。