植物に存在するIAM経路のオーキシン生合成遺伝子に関する研究

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Agrobacterium等の植物病原菌に観察されるインドールアセトアミド(IAM)を経由するオーキシン(IAA)生合成経路の植物からの遺伝子クローニングを目的とし、材料的に最も得やすい、イネの培養細胞(Oryza sativa 日本晴)を用いてインドールアセトアミドヒドロラーゼ(IAM→IAA)の精製を行った。硫安沈殿、ゲル濾過、陰イオン交換カラム、MiniQ^<TM>カラムによる精製により、最終的に358.8倍まで精製した。この酵素はSDS-PAGEとゲル濾過の分析により50kDの分子量を有し、KmはIAMに対して0.96mM、インドールエチルエステルに対して0.55mMであることが判明した。またAgrobacteriumのIAMヒドロラーゼよりも加熱あるいは冷蔵保存に対して極めて安定であった。酵素の部分的アミノ酸配列の決定を試みたが、精製度の問題で明確にアミノ酸配列を読むことはできなかった。現在イネの培養細胞からcDNAを調製しE. coliでの発現ベクターを使用した活性発現からのクローニングを進行中である。一方植物からのトリプトファンモノオキシゲナーゼ(Trp→ IAM)遺伝子のクローニングは、バクテリアで既にクローニング及びシークエンシングされている7種の同遺伝子の相同性をもとに、約10種類のプライマーを作成し、カラタチDNAからのPCRによるDNA断片のクローニングを試みた。いろいろなPCRの条件を試してみたが、残念ながら未だ部分断片のクローニングには成功していない。