ヒマワリから単離されたミトコンドリア雄性不稔遺伝子の分子生物学的研究

向日葵线粒体雄性不育基因的分子生物学研究

• 批准号: 07760008
• 负责人: 寺地 徹
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kyoto Sangyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760008/
• 关键词: ミトコンドリア; 雄性不稔; ヒマワリ; orf522遺伝子

本申請課題では,雄性不稔ヒマワリのミトコンドリアのorf522遺伝子を大腸菌発現ベクターのひとつ、pMAL-p2、を用いて発現させるとその大腸菌が致死になるという、申請者の新しい発見(Nakai et al. 1995)に基づいて、orf522遺伝子コード領域の変異体を作製し、致死作用をもたらすこのタンパク質の機能領域を絞り込むことを最初の目標に掲げた。そのため、この遺伝子のコード領域に存在する各種制限酵素切断部位を利用して種々のサブクローンを作製する実験、ならびにExoIII/Mung bean両ヌクレアーゼを用いて各種欠失変異体を作製する実験をともに実施し、その結果を検討した。また、新たな大腸菌発現ベクター、pGEX、にorf522遺伝子コード領域全体をクローニングし、産物の大腸菌への致死作用を再検討する実験も試みた。しかしながら、オリジナルのpMAL-p2/orf522では大腸菌への致死作用に関して再現性が確認されたものの、上記の実験により作製された各種プラスミドの中には大腸菌に明瞭な致死作用を示すものは無く、当初の目的を達成できていない。そこで急遽、PCRにより欠失変異体を作製することに方針を転換し、本研究費によりPCRプライマーを購入した。実験は継続中であり、この結果は近日中に明らかになる予定である。なお、本研究費で購入した装置によりタンパク質を大量に精製する系でが確立できたので、今後、今回の実験で作製したorf522遺伝子の各種変異体からタンパク質を調製し、抗体を作製する予定である。

在此应用中，最初的目标是创建一个ORF522基因编码区的突变体，该突变体使用PMAL-P2表示，该突变体是使用PMAL-P2（大肠杆菌表达载体之一）表达的，并通过产生ORF522基因编码区域的突变体来缩小该蛋白质的功能区域，该功能具有致死作用。因此，我们进行了实验，其中使用该基因编码区域中存在的各种限制酶裂解位点产生了各种亚克隆，以及使用Exoiii/mung bean nuclease产生了各种缺失突变体的实验，并检查了结果。我们还试图将整个ORF522基因编码区克隆到新的大肠杆菌表达载体，PGEX，并重新检查产物对大肠杆菌的致命作用。但是，尽管原始的PMAL-P2/ORF522证实了对大肠杆菌的致命作用的可重复性，但上述实验中产生的各种质粒均未对大肠杆菌产生明显的致命作用，并且尚未实现最初的目的。因此，我们突然改变了通过PCR创建缺失突变体的政策，并以牺牲这项研究为代价购买了PCR底漆。实验正在进行中，结果将很快揭示。此外，由于已经建立了使用为这项研究的资金购买的设备大量净化蛋白质的系统，因此我们计划从本实验中产生的ORF522基因的各种突变体中制备蛋白质，并在将来产生抗体。