コムギと近縁種を用いたRNA編集の分子機構に関する研究

利用小麦及相关物种进行RNA编辑的分子机制研究

• 批准号: 05760009
• 负责人: 寺地 徹
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kyoto Sangyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760009/
• 关键词: ミトコンドリア; RNA編集; パンコムギ; coxII遺伝子; RT-PCR

本奨励研究では高等頭植物のミトコンドリアにおけるRNA編集という奇妙な現象について、その原因を分子レベルで明らかにすることを最終的な目標とする。そのため,遺伝志学知見の豊富なパンコムギとエギロプス属植物を実験材料に、in vivoにおけるRNA編集の実態の詳細な把握と、in vitroにおけるRNA編集系の再現の、いわゆるvivo/vitro両面からこの現象を究明すべく実験計画を立てた。しかしながら、前者に関しては後述するように一定の成果があがったものの、後者、特にRNA編集に関与する因子の探索については、時間的な制約から実験が大幅に遅れており、今後の課題として残っている。In vivoにおけるRNA編集の研究では、まずパンコムギからミトコンドリアを常法により単離してRNAをAGPC法により抽出した。次に幼植物から全RNAを同じ方法で抽出した。これらのRNAを鋳型として、ミトコンドリアのatpA-atp9、coxl両遺伝子領域を標的としてRT-PCRを行ったところ、いずれのRNA調製物からも期待されるcDNA増幅産物を得ることができた。このことは、比較的抽出が容易な、全RNAからミトコンドリアのRNA編集を解析する道が開けたことを意味しており、その後の実験系を確立する上で大きな意義があった。一方、このRT-PCRを主体とする分析手法では、RNA抽出物に僅かに混入するDNAが問題になること、しかもこれを完全に除くことが極めて困難なことが今回の研究によりわかった。従ってイントロンを含む遺伝子をRNA編集の分析対象とするのが望ましいと考え、計画時のatpA-atp9からcoxl遺伝子へ分析対象を変更した。また、非 環境下での塩基配列決定法を改良し、SSCPではなく塩基配列によりRNA編集の頻度を決めることが可能となったので、この手法により、パンコムギ、細胞質置換コムギのcoxl遺伝子のRNA編集の正確さを比較した(進行中)。

这项激励研究旨在阐明在分子水平上高位植物线粒体中RNA编辑奇怪现象的原因。因此，我们制定了一个实验计划，以使用遗传野心的丰富知识和Egilopus属作为实验材料来研究RNA编辑系统的体内和所谓的体内和体外方面的这种现象。但是，尽管对前者已经取得了某些结果，但由于时间限制，后者尤其是在寻找RNA编辑中涉及的因素时已大大延迟，并且仍然是未来的挑战。在体内RNA编辑的研究中，首先通过常规方法从面包小麦中分离线粒体，而RNA由AGPC提取。然后以相同的方式从幼苗中提取总RNA。将这些RNA用作模板，使用线粒体ATPA-ATP9和Coxl基因区域作为靶标进行RT-PCR，并获得从两种RNA制剂中可以预期的cDNA扩增产物。这意味着相对容易的提取为分析总RNA的线粒体RNA编辑开辟了道路，这对于建立随后的实验系统非常重要。另一方面，这种分析方法主要涉及RT-PCR，这项研究表明，被RNA提取物略微污染的DNA成为一个问题，并且很难完全删除它们。因此，希望使用包含内含子作为RNA编辑的靶标是可取的，因此我们在计划期间将分析的目标从ATPA-ATP9更改为Coxl基因。此外，由于已经改善了非环境测序方法，因此可以根据基础序列而不是SSCP来确定RNA编辑的频率，因此该技术已用于比较面包小麦和细胞质量替代的小麦中Coxl基因的RNA编辑的准确性。