ダイコンのオグラ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子のクローニング

日本萝卜小仓型雄性不育细胞质中育性恢复基因的克隆

• 批准号: 08760007
• 负责人: 寺地 徹
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto Sangyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760007/
• 关键词: 稔性回復遺伝子; ダイコン; 雄性不稔; AFLP; ミトコンドリア

本研究課題ではダイコンのオグラ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子の単離を究極の目的に分子遺伝学的実験を行った。今年度の実験では遺伝子を実際にクローニングすることはできなかったが、そのための基礎となる稔性回復遺伝子と連鎖するDNAマーカーの選抜について、方法論的に格段の進展をみた。すなわち、申請書記載のRAPD法に変えて、AFLP法を非RI環境下で実施できるよう改良し適用した結果、連鎖DNAマーカーの選抜効率が飛躍的にあがった。具体的には、植物材料としてダイコン雄性不稔系統'MS源助'と稔性回復系統'コメット'、ならびにこれら2系統の交配により得られた多数のF2個体を用い、定法によってまずこれらの全DNAを調製した。F2各個体の稔性を調査して可稔・不稔に区分けした後、区ごとにDNAを等量ずつ混合し、可稔・不稔両バルクDNAを調製した。AFLP分析に用いるプライマーをDig標識し、前述のバルクDNAを鋳型にPCRを行った後、増幅DNA断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。DNA断片をナイロン膜へ転写した後、アルカリフォスファターゼを結合した抗Dig抗体を反応させ、化学発光によりX線フィルムを露光した。この方法により非RI環境下で従来のRI標識による方法と同等のAFLPパターンを初めて検出することができた。本実験では、僅か2つのプライマーペアにより、約130ものバンドを検出することができたが、可稔・不稔両バルク間のAFLPパターンはほとんど同一であった。その中で不稔バルクには存在せず、可稔バルクに特異的に存在するAFLPバンドを1本発見することができた。また、親系統のAFLPパターンの解析から、このバンドが'コメット'由来であることもわかった。現在、このバンドをクローニングして解析するとともに、稔性回復遺伝子単離の起点として適当か否か種々の検討を重ねている。

在这个研究主题中，我们进行了分子遗传实验，其最终目标是将恢复生育能力恢复到萝卜的Ogura型雄性无菌细胞质的基因。尽管今年的实验无法实际克隆基因，但我们在选择与潜在的生育能力恢复基因相关的DNA标记方面看到了显着的方法学进步。换句话说，申请表中描述的RAPD方法已将其更改为RAPD方法，并且改进了AFLP方法并将其应用于非RI环境中，从而在非RI环境中实现，从而极大地提高了链接的DNA标记的选择效率。具体而言，作为植物材料，萝卜雄性无菌系“女士”和生育恢复线“彗星”以及通过越过这两条线获得的大量F2个体首先是通过标准方法制备的。研究了每个单独的F2的生育能力，并将其分为肥沃和无菌，然后将相等量的DNA用于每个部分，以制备肥沃的和无菌的体积DNA。将用于AFLP分析的引物进行挖掘标记，并使用上述散装DNA作为模板进行PCR，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离放大的DNA片段。将DNA片段转移到尼龙膜上后，对与碱性磷酸酶结合的抗DIG抗体进行了反应，并通过化学发光暴露了X射线膜。该方法已用于检测第一次在非RI环境中与常规RI标记方法等效的AFLP模式。在该实验中，只能通过两个底漆对检测到多达130个频段，但是肥沃的和无菌体积之间的AFLP模式几乎相同。其中，发现了一支不存在于无菌体积且专门存在于无菌体积中的AFLP谱带。父母AFLP模式的分析还表明，该频段源自“彗星”。当前，该频段被克隆和分析，并且正在对它是否适合作为隔离生育能力恢复基因的起点进行各种研究。

项目成果

村山誠治・山岸博・寺地徹: "ダイコンにおけるAFLP分析I、バルク法を用いたオグラ稔性回復遺伝子に連鎖するAFLPマーカーの選択" 育種学雑誌. 第46・別2(発表予定). (1997)

Seiji Murayama、Hiroshi Yamagishi、Toru Terachi：“日本萝卜的 AFLP 分析 I，使用批量方法选择与 Ogura 育性恢复基因相关的 AFLP 标记”《育种科学杂志》第 46 期，第 2 部分（1997 年）。 ）