遺伝子工学の手法を用いた高等植物ミトコンドリアタンパク質の単離精製法の確立

利用基因工程技术建立高等植物线粒体蛋白分离纯化方法

• 批准号: 06760009
• 负责人: 寺地 徹
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto Sangyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760009/
• 关键词: ミトコンドリア遺伝子; 発現ベクター; 雄性不稔; Helianthus; orf522遺伝子; atpA遺伝子

本申請課題では、細胞質雄性不稔など植物育種学上重要な形質に関与すると考えられているミトコンドリアゲノム上の遺伝子とその産物の機能を、タンパク質の側から解明することを最終目的にしている。しかし一般に植物ミトコンドリアのタンパク質は、旧来の生化学的手法で大量調製することが難しく、新たな実験手法の開発が切望されていた。そこで本申請課題では、タンパク質を植物体から直に調製するのではなく、それに対応するcDNA断片を大腸菌の発現ベクターにクローニングして大量発現させ、大腸菌のライゼ-トから目的タンパク質を精製する実験系を確立することを当面の研究課題とした。これについて、まず、エンドウのatpA遺伝子と発現ベクターpMAL-c2を用いて、ミトコンドリアタンパク質の大腸菌内での発現と精製の予備的な実験を行った。その結果、大腸菌の破砕条件や最終精製過程で更に検討の余地はあるものの、この実験系で期待通りエンドウATPAタンパク質を大量に調製可能であることがわかった。これをうけて、次に、ヒマワリの雄性不稔の原因として疑われているorf522遺伝子産物を、上記と同じ方法で大量調製することを試みた。しかしながら、今度は予期に反し、目的のコンストラクトをもつ組換体自体を容易に得ることができなかった。そこでこの結果を注意深く検討し、orf522遺伝子の再クローニングを進めた結果、orf522遺伝子産物が大腸菌を致死にするという予想外の結論に達した。したがってこの実験でORF522タンパク質を大量調製することには成功しなかったが、今回見いだされた新事実は高等植物の雄性不稔との関連で非常に興味深いと考えられるので、実験結果をまとめ学会誌に投稿した。

该应用的最终目标是阐明线粒体基因组中基因及其产物的功能，从蛋白质的角度来看，人们认为这与重要的植物育种特征（如细胞质雄性无菌性）有关。但是，通常很难使用传统的生化技术来制备大量植物线粒体蛋白，并且高度需要新的实验方法。因此，在此应用中，直接的研究主题是建立一个实验系统，在该系统中，未直接从植物中制备蛋白质，而是克隆相应的cDNA片段到大肠杆菌表达载体中并表达大量量，并从大肠杆菌裂解物中纯化靶蛋白。在这方面，我们首先使用PEA ATPA基因和表达载体PMAL-C2进行了初步实验，以对大肠杆菌中线粒体蛋白的表达和纯化。结果，尽管在破坏大肠杆菌和最终纯化过程的条件下还有进一步研究的空间，但发现该实验系统可以产生大量的PEA ATPA蛋白。下一步，我们接下来尝试准备大量的ORF522基因产物，这被怀疑是向日葵中男性无菌性的原因，其方式与上述方式相同。但是，这一次与期望相反，重组本身与感兴趣的结构并不容易获得。因此，我们仔细检查了这一结果，并进行了ORF522基因的重音，并得出了意外的结论：ORF522基因产物会杀死大肠杆菌。因此，尽管该实验在准备大量ORF522蛋白方面没有成功，但这次发现的新事实对于高等植物中的雄性不育而被认为非常有趣，因此将实验结果汇编并提交给该期刊。

项目成果

Nakai,S. et al.: "High-level expression of at a mitochondrial orf522 gene from the mule-sterile sunflower is lethal to E.coli." 育種学雑誌. 45(発表予定). (1995)

Nakai, S. 等人：“骡不育向日葵的线粒体 orf522 基因的高水平表达对大肠杆菌是致命的。”《育种科学杂志》45（即将出版）。