神経伝達物質の放出過程を阻害する生理活性物質の探索とその作用の解析

寻找抑制神经递质释放过程的生理活性物质并分析其作用

基本信息

批准号：
07760076
负责人：
有岡学
金额：
$ 0.7万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

一次検索系としてPC12細胞からのノルエピネフリン(NE)放出阻害を指標とし、カビ2200株、放線菌3600株の培養抽出液の検索を行った。続いて二次検索系としてCa^<2+>イオノフォアであるイオノマイシン(1mM)存在下に同様の実験を行った。再現性よく阻害活性が認められたものについて、さらにATPの放出阻害についても検討した。その結果、カビからの2サンプル(LF11039、LF10512)、および放線菌からの2サンプル(LS8877、LS9940)に顕著な阻害活性を見出した。これについてさらに三次検索系として好中球からのβ-グルクロニダーゼ放出に対する作用を調べた。その結果LF11039、LF10512、LS9940はいずれも強い阻害活性を示したが、LS8877は阻害よりもむしろ若干促進するという結果を得た。このことから、前三者は調節性分泌に共通する過程(おそらく膜融合過程)の阻害剤であるが、LS8877は神経伝達物質の放出に特異的な阻害剤であることが示唆された。またアクリジンオレンジを用いて酸性オルガネラに対する作用を調べた結果、候補物質はいずれも阻害活性を示さず、分泌阻害剤であるコンカナマイシン類とは作用が異なることがわかった。さらに候補物質の毒性をPC12細胞を用いて調べたところ、いずれもNE放出を阻害する濃度で増殖の抑制はみられなかった。この結果は候補物質が調節性分泌に特異的な機構を標的としていることを示唆する。次に各活性物質の精製を行った。比較的活性の強いLF11039株を大量培養し、菌体から80%アセトン抽出、酢酸エチル転溶後2回のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、約19mgの淡黄色の結晶を得た。本物質は230、252、320、370nmの各波長に吸収極大を示し、またFAB-MSスペクトル解析の結果分子量が390であることが解った。^1H-および^<13>C-NMR解析から15〜16個の炭素のシグナルが認められ、それらがいずれもSP^2炭素であることが示唆された。LF10512、LS8877、LS9940についても精製を試みている。以上いずれの物質も最終的な構造決定には至っていないことから、引き続き精製・機器分析を行い、活性物質の本体を明らかにしたい。

作为主要搜索系统，使用抑制去甲肾上腺素（NE）从PC12细胞释放的培养物进行了2200次真菌和3,600个放线菌的培养提取物作为指数。随后，在离子霉素（1 mM）（1 mm）（Ca^<2+>离子载体）存在的情况下进行了类似的实验。对于具有可再现抑制活性的人，我们还研究了ATP释放的抑制作用。结果，我们发现了来自霉菌的两个样品（LF11039，LF10512）的显着抑制活性，以及来自放线菌的两个样品（LS8877，LS9940）。此外，我们研究了对β-葡萄糖醛酸苷酶从中性粒细胞释放的影响，作为第三级搜索系统。结果表明，LF11039，LF10512和LS9940均表现出很强的抑制活性，而LS8877稍微促进而不是抑制。这表明LS8877是调节分泌过程（可能是膜融合过程）的过程的特定抑制剂，而LS8877是一种特异性的神经递质释放的抑制剂。此外，当使用Acridine Orange研究对酸细胞器的影响时，发现候选物质没有表现出抑制活性，并且与分泌抑制剂康卡纳霉素具有不同的作用。此外，当使用PC12细胞研究候选物质的毒性时，没有一个细胞表明，在抑制NE释放的浓度下，生长受到抑制。该结果表明，候选人针对针对调节分泌的机制。接下来，纯化每种活性物质。培养了大量相对活性的LF11039菌株，从细胞中提取80％丙酮后，将乙酸乙酯转化为在硅胶柱色谱上溶解两次，获得了约19毫克的浅黄色晶体。该材料在230、252、320和370 nm的波长下表现出最大吸收，发现FAB-MS的分子量为390。 ^1H-和 ^<13> C-NMR分析显示15-16碳信号，表明它们都是SP ^2 Carbons。 LF10512，LS8877和LS9940也正在尝试纯化。由于上述物质尚未完成以确定结构，因此我们希望继续纯化和仪器分析以阐明活性物质的主体。