神経栄養因子様の活性を有する新規蛋白質p15の作用機序の解析

具有神经营养因子样活性的新型蛋白p15的作用机制分析

基本信息

批准号：
12760048
负责人：
有岡学
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

我々はこれまで糸状菌由来のタンパク質p15がPCl2細胞の分化を誘導し、突起伸長を顕著に促進すること、またpl5が分泌型ホスホリパーゼA_2(sPLA_2)の一種であり、同活性が上記の生物活性に必須であることを明らかにしてきた。本研究期間内においてはpl5の培養マウス小脳顆粒神経細胞(CGN)に対するアポトーシス抑制活性を検討し、sPLA_2が神経栄養因子様の作用を有する可能性について検討した。CGNは生後7日目のマウス小脳より単離し、高カリウム(K^+)培地で培養した。低K^+培地にシフトすることによりアポトーシスを誘導しヘキスト染色を行ったところ、アポトーシス細胞に特徴的な凝集した核形態が観察された。大腸菌で生産した組換えp15を添加した低K^+培地では核凝集が抑制され、またTUNEL陽性細胞も減少したことから、p15にCGNのアポトーシスを抑制する活性があることが分かった。一方、sPLA_2の活性中心と予想されるHD残基をAAに置換した変異型p15では細胞死の抑制が認められなかった。さらに、p15によるCGNからの脂肪酸の遊離と細胞死抑制活性とが相関することを明らかにした。マウスのcDNAライブラリーよりグループIB, IIA, V, X-sPLA_2をクローニングし、COS1細胞に融合タンパク質として発現させた。培養上清をPC12細胞に与えたところ、IB, IIAは突起を伸長しなかったが、V, Xは突起伸長活性を有していた。次に、上記の4つに加えてマウスグループIIEをクローニングし、合わせて合計5種類のマウスsPLA_2について大腸菌で発現させ、S-S結合の再生処理行って活性型の精製タンパク質を得た。これらのマウス小脳顆粒細胞に対する生存維持活性を検討したところ、少なくともXについては生存維持活性が認められ、BDNF・IGF-1による生存維持を増強することが明らかとなった。

我们先前已经表明，源自丝状真菌的蛋白质p15诱导PCL2细胞的分化并显着促进突出延长，并且PL5是一种分泌磷脂酶A_2（SPLA_2）的一种类型，并且同一活性对于上述生物学活性至关重要。在本研究期间，我们研究了PL5对培养的小鼠小脑颗粒神经元（CGNS）的抑制活性，并检查了SPLA_2具有神经营养因子样效应的可能性。在出生后的第7天，将CGN从小鼠小脑中分离出来，并在高钾（K^+）培养基中培养。通过转移到低K+培养基并进行染色来诱导凋亡，并观察到凋亡细胞的综合核形态特征。核电聚集在大肠杆菌中产生的重组P15的低k^+培养基中被抑制，而Tunel阳性细胞也降低，表明p15具有抑制CGN凋亡的活性。另一方面，在突变体p15中未观察到细胞死亡的抑制作用，其中预期HD残基被AA替换为SPLA_2的活跃中心。此外，揭示了P15从CGN释放脂肪酸，并且细胞死亡抑制活性相关。从小鼠cDNA库克隆了IB，IIA，V和X-SPLA_2组，并在COS1细胞中表示为融合蛋白。当培养上清液被喂入PC12细胞时，IB和IIA并没有扩展突出，而V和X具有突出的延伸活性。接下来，除了上述四个，小鼠组IIE被克隆，总共在大肠杆菌中表达了五种类型的小鼠SpLA_2，并重新生成S-S结合以获得活性纯化的蛋白质。当我们研究针对这些小鼠小脑颗粒细胞的生存维持活性时，至少观察到X保持生存率，并且发现它通过BDNF和IGF-1提高了生存维持。