神経栄養因子様の活性を有する新規蛋白質p15の作用機序の解析

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我々はこれまで糸状菌由来のタンパク質p15がPCl2細胞の分化を誘導し、突起伸長を顕著に促進すること、またpl5が分泌型ホスホリパーゼA_2(sPLA_2)の一種であり、同活性が上記の生物活性に必須であることを明らかにしてきた。本研究期間内においてはpl5の培養マウス小脳顆粒神経細胞(CGN)に対するアポトーシス抑制活性を検討し、sPLA_2が神経栄養因子様の作用を有する可能性について検討した。CGNは生後7日目のマウス小脳より単離し、高カリウム(K^+)培地で培養した。低K^+培地にシフトすることによりアポトーシスを誘導しヘキスト染色を行ったところ、アポトーシス細胞に特徴的な凝集した核形態が観察された。大腸菌で生産した組換えp15を添加した低K^+培地では核凝集が抑制され、またTUNEL陽性細胞も減少したことから、p15にCGNのアポトーシスを抑制する活性があることが分かった。一方、sPLA_2の活性中心と予想されるHD残基をAAに置換した変異型p15では細胞死の抑制が認められなかった。さらに、p15によるCGNからの脂肪酸の遊離と細胞死抑制活性とが相関することを明らかにした。マウスのcDNAライブラリーよりグループIB, IIA, V, X-sPLA_2をクローニングし、COS1細胞に融合タンパク質として発現させた。培養上清をPC12細胞に与えたところ、IB, IIAは突起を伸長しなかったが、V, Xは突起伸長活性を有していた。次に、上記の4つに加えてマウスグループIIEをクローニングし、合わせて合計5種類のマウスsPLA_2について大腸菌で発現させ、S-S結合の再生処理行って活性型の精製タンパク質を得た。これらのマウス小脳顆粒細胞に対する生存維持活性を検討したところ、少なくともXについては生存維持活性が認められ、BDNF・IGF-1による生存維持を増強することが明らかとなった。