高等動物におけるビタミンB12補酵素の合成機構の解明

阐明高等动物维生素B12辅酶的合成机制

• 批准号: 07760139
• 负责人: 渡辺 文雄
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Kochi Women's University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760139/
• 关键词: ビタミンB12; アデノシル化酵素; 補酵素合成; コバラミン; ラット肝臓

ビタミンB12(B12)の生理機能の発現に極めて重要であるB12補酵素の合成機構については現在もなお不明な点が多く残されている。高等動物のB12の補酵素の合成機構を解明するために、B12補酵素合成系の最終段階を食媒するB12sアデノシル化酵素に着目した。まず本酵素の正確な活性測定法を確立し、その後詳細な酵素化学的性質を検討した。本酵素の基質であるB12sは水溶液中では非常に不安定で、容易に酸化されB12aとなる。また、B12s/B12aの酸化還元電位は非常に低いために、穏和な条件下で人工的にこの基室を調製することは極めて困難である。そこで、本酵素の生成物であるアデノシルB12からB12sへの逆反応を利用して、生成されたB12sが酸化型2、4-ジニトロフェノールインドフェノール(DCIP)を還元する時の600nmの光吸度変化をダブルビーム分光光度計で検出することで本酵素活性を測定する新規な測定法を開発した。本法はDCIPが比較的高い分子吸光係数(22000)を有するによりpmol/min/mg proteinオーダーまで測定できた。本活性測定法を用いて原生動物のEuglena gracilis Zとラット肝臓の無細胞抽出液を用いてB12sアデノシル化酵素の諸性質を調べた。いずれの生物の酵素も基質のアドノシルB12、Mg^<2+>(Euglena)あるいはMn^<2+>(ratliver)、トリポリリン酸が活性発現に必須であった。また、至適pHは8.5付近であり、至適温度は40℃であった。Rat liverの酵素は細胞内ではミトコンドリアにのみ局在していたが、本酵素活性はイオン交換カラムクロマトグラフィーにおいて3種のピークに分離されたが、ゲル濾過によりいずれも分子量28000に単一のピークとして溶出された。これらの結果は本酵素にアイソザイム、あるいは多様な分子種の存在が示唆された。また、これと同様な結果がEuglenaにおいても観察された。本研究により初めて高等動物のミトコンドリアに多様なB12sアデノシル化酵素が存在することが明らかになった。

The development of physiological function of B12(B12) is extremely important. The synthesis mechanism of B12 complement enzyme is unknown. B12 enzyme synthesis mechanism in higher animals is discussed in detail. To establish the correct enzyme activity assay, and then to discuss the chemical properties of the enzyme in detail The enzyme substrate B12s is very unstable in aqueous solution and easily acidifies B12a. The acidification potential of B12s/B12a is very low and difficult to modulate artificially. A new method for measuring the activity of this enzyme was developed by using the reverse reaction of B12 and B12s to produce acidified B12s (DCIP) and by measuring the absorbance at 600nm by spectrophotometry. This method can be used to determine the absorbance coefficient (22000) of high molecular weight DCIP. This activity assay uses the cell-free extract of protozoan Euglena gracilis Z to modulate the properties of B12s enzymes. The enzyme matrix of these organisms is required for the activation of B12, Mg^<2+>(Euglena), Mn^<2+>(ratliver), and Triton.また、至适pHは8.5付近であり、至适温度は40℃であった。Rat liver enzyme in the cell, the enzyme activity of the three kinds of separation, filtration, molecular weight of 28000, the enzyme dissolution The result is that there are multiple molecular species present in the enzyme. The result is Euglena. The present study is aimed at investigating the presence of B12s in higher animals.