高等動物におけるビタミンB_<12>補酵素の合成機構の解明

高等动物维生素B_<12>辅酶合成机制的阐明

• 批准号: 06760132
• 负责人: 渡辺 文雄
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Hagoromo Gakuen Junior College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760132/
• 关键词: ビタミンB_<12>; コバラミン; 補酵素合成; ラット肝臓; ヒト線維芽細胞; 先天性代謝異常; アクアコバラミンレダクターゼ

アクアコバラミンレダクターゼ酵素の遺伝的な異常に起因する先天性ビタミンB_<12>代謝異常症患者より分離したヒト皮膚線維芽細胞(cblC:WG1998)と正常細胞(WI-38P23)を10%FBSを含むDNEM培地で培養後、テフロンホモジナイザーを用いて細胞を破砕し、分画遠心法によりミトコンドリアとミクロソーム画分を単離した。この両画分を用いてNADH型とNADPH型アクアコバラミンレダクターゼアイソザイム活性を測定した。その結果、正常細胞に較べcblC細胞ではミトコンドリアのNADH型酵素の活性のみが顕著に低下していた。そこでウエスタンブッテングを行い本酵素の細胞内タンパク質レベルを調べたところ、正常細胞との間に顕著な差異はなかった。この結果より、cblC細胞での活性の低下が酵素タンパク質の発現レベルの低下に起因するものではないことが明らかとなった。次にミトコンドリア画分を用いて本酵素の速度論的解析を行った。その結果、cblC細胞の酵素は正常細胞の酵素よりも基質であるアクアコバラミンに対する親和性が約1/2に、またNADHに対しては約1/3に低下していた。この結果からcblC細胞におけるミトコンドリアのNADH型アクアコバラミンレダクターゼの活性低下は両基質に対する親和性の低下によることが明らかとなった。恐らく、酵素タンパク質の活性中心付近のアミノ酸のポイントミューテイションにる遺伝的障害であることが推定される。現在、これらの結果を論文としてまとめている。

The cause of abnormal enzyme expression was congenital vitiligo B_<12>metabolic disorder. The cells were isolated from normal skin cells (WI-38P23) and normal skin cells (cblC:WG1998). After culture with DNEM, the cells were isolated from normal skin cells by 10% FBS. The activity of NADH and NADPH was measured in this assay. As a result, the activity of NADH-type enzymes in normal cells was significantly lower than that in normal cells. In addition, there are differences in the intracellular quality of the enzyme, and in the normal cells. As a result, the activity of cblC cells is reduced, and the cause of the decrease in enzyme activity is reduced. This enzyme is used in the analysis of velocity theory. As a result, cblC cell enzyme affinity was about 1/2 lower than that of normal cell enzyme, and NADH affinity was about 1/3 lower than that of normal cell enzyme. This result is clearly due to the low activity of the NADH-type receptor in cblC cells and the low affinity for the substrate. The active center of the enzyme is close to the active center of the enzyme. Now, this is the result of the paper.