低出力レーザーのイオンチャネルへの作用による鎮痛作用機序の解明

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成熟ラットをネンブタール麻酔(40mg/kg,i.p.)後、節状神経節を摘出し、細胞分離のためにtrypsin(Gibco)1.2mg/ml, collagenase(Wako)1.2mg/mlを含むハンクス液に入れ、15分間37℃で処理後、trypsin inhibitorを入れて細胞の崩壊を防いだ後、collagenase(Wako)1.2mg/mlを含むハンクス液に入れ、20分間37℃で処理後、細胞の分離をよくするためにピペッテングした。分離した細胞をハンクス液で2回洗浄後、培養液(DMEM)に移しかえ、CO_2インキュベータ-にて12時間保存し培養した。その後、低出力レーザーを培養細胞に直接照射し、ホールセルパッチクランプ法を用いて細胞膜イオンチャネルへの影響を記録した。低出力レーザー照射(0.006-9J)により、記録した62%の細胞で脱分極を、17%で過分極を認めた。脱分極変化量は0.006-0.036Jの照射では仕事量依存的に増加、それより大きな仕事量では逆に低下し、0.05-9Jでは14mVの一定値であった。静止膜電位の脱分極からの回復は小仕事量群では53%に、大仕事量群では27%に認められ、回復例では脱分極の再現性が認められた。膜電位を-50mVに固定し、レーザー照射(0.016J)すると内向き電流の増加(最大値-230pA)が認められた。この内向き電流は50mM TEAで変化せず、2μM TTXで完全に阻害された。膜電位を-80mVに固定し、脱分極刺激をしたときのレーザー照射(0.012J)によるNa^+電流の電流-電圧関係への影響を検討した。照射後4分において-40から+50mVの範囲の脱分極刺激により照射前と比較して、175%から350%の増大を認めた。照射後6分には、ほぼ照射前のレベルまで回復した。現在、レーザー照射によるNa^+channelの開閉機構に対する作用を詳細に検討する予定である。