P型イオン輸送性ATPaseの細胞内局在化におけるβサブユニットの役割

β亚基在 P 型离子转运 ATP 酶细胞内定位中的作用

• 批准号: 07770034
• 负责人: 野口 俊介
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyushu Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770034/
• 关键词: (Na,K) ATPase; (H.K) ATPase; β-subunit; Caco-2; sorting; assembly

1. 発現系の構築昨年度に引き続き表裏の方向性を持つような上皮細胞系における,外来(Na,K) ATPaseβサブユニットまたは(H,K) ATPaseβサブユニットの発現系構築を行った.外来βサブユニット発現のための発現プラスミドはcytomegalovirus immediate early enhancer/promoterを持つ動物細胞用発現ベクターpCEP4を用いて、シビレエイTorpedo califomica発電器官由来の(Na,K) ATPaseβサブユニットcDNAを含む発現プラスミドpCEPNβ,ブタ胃壁由来の(H,K) ATPaseβサブユニットcDNAを含む発現プラスミドpCEPHβをそれぞれ構築した.これらの発現プラスミドpCEPNβ,pCEPHβをClaI切断により直線化し電気穿孔法によりCaco-2に導入した.ベクターのハイグロマイシン耐性遺伝子により遺伝子組換体の選択を行いそれぞれ3×10^6個の細胞からpCEPNβでは3個,pCEPHβでは4個のハイグロマイシン耐性の安定形質転換体を得た.導入遺伝子の発現を確認するため,それらからtotal RNAを抽出し,それぞれ(Na,K) ATPaseβプロープ,(H,K) ATPaseβブロープを用いてノザンハイブリダイゼ-ジョンを行った.その結果いずれの形質転換体でも導入遺伝子の発現は見られなかった.このためベクターをSV40の初期遺伝子プロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして持つpREP9に換え,発現プラスミドを構築し直しpREP9N,pREP9Hを得た.これらをClaIにより直線化し電気穿孔法によりCaco-2に導入した.ネオマイシンによる選択の結果,それぞれ3×10^6個の細胞からpREP9Nでは2個,pREPqHでは4個のネオマイシン耐性安定質転換体を得た.現在ノザンハイブリダイゼーションによる導入遺伝子の発現の確認を行っている.2.生合成初期におけるαβ相互作用3分から10分の短時間標識に於ても,αサブユニットの共存によるβサブユニットの発現量の低下が見られ,生合成の極く初期にすでにαβ間の相互作用が起こっていることが示唆された.またこの際にαでは77kDα,βでは41kDaの分子種が存在することが見いだされた.これらはその分子量からaではM7の後ろのβとのアセンブリーサイト付近,βでは3番目のS-S結合の直後で生合成が中断しているものと考えられ,αβアセンブリーに備えている前駆体ではないかと推定された.実際α由来の77kDa産物はαサブユニットのC末端に対する抗体と反応せず,分解物ではなく合成が中断した分子種であることが確認された.

1. In the last year, the direction of the epithelium of the cell line is different from that of the exotic (Na,K) ATPase β-cell line, the exotic ATPase β-cell line, the exotic cell line and the exotic cell line. The extraneous β-phenotypic acid has been detected. The cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter has been used to detect pCEP4, Na,K, Torpedo califomica, organ origin (Na,K), ATPase β, organ origin, cDNA, pCEPN β, stomach wall ATPase β, stomach cDNA, cDNA, pCEPH β, cDNA, etc. The pCEPN β, pCEPH β ClaI was cut off and the direct electricity punching method was used to induce the Caco-2 to enter the battery. The sub-group selected 3 × 10 ^ 6 cell lines for 3 × 10 ^ 6 cells, 3 for pCEPN β, and 4 for pCEPH β for endurance tolerance. Import the child to make sure that you are not aware of the problem, that is, the total RNA extract, the Na,K, the ATPase β, and the ATPase β, which are the key words in the code. The results show that the shape of the body is broken into the child, and you can see that there is a problem. In the early stage of the SV40, you may choose to make sure that you have a pREP9 problem, and that you will be able to get a straight pREP9N,pREP9H. The direct ClaI piercing method is used to transfer the Caco-2 into the computer. The results of the election were 3 × 10 ^ 6 cells, 2 pREP9N and 4 pREPqH, respectively. The tolerance stability test was successful. Now, please confirm that you have confirmed that the line is correct. 2. In the early stage of synthesis, the alpha β interaction is not known for 3 minutes and 10 minutes for a short period of time, and for the coexistence of alpha and alpha compounds, there is a low level of activity in the first phase of biosynthesis. in the early stage of synthesis, the interaction between alpha and beta compounds in the initial stage of synthesis is instigated. The molecular weight of 77kD α, β 41kDa exists in the presence of a large number of molecules. The molecular weight (MW), molecular weight (MW), molecular weight, molecular weight, molecular The origin of the 77kDa compound is alpha, and the C-terminal antibody reacts, and the decomposer disrupts the synthesis of the molecular species.