ヒト胎児性癌細胞の分化とアポトーシスにおける熱ショック蛋白HSP90の機能解析

热休克蛋白HSP90在人胚胎癌细胞分化和凋亡中的功能分析

基本信息

批准号：
07770163
负责人：
山田健人
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト初期胚発生の分子機構を明らかにすることは細胞生物学のみならず腫瘍発症機構の解明に重要な寄与をする。われわれが樹立したヒト精巣混合型胎児性癌由来EC細胞株G3は多分化能を有するとともにその分化過程でアポトーシスが惹起される。今まで,ヒトEC細胞の初期分化において熱ショック蛋白質HSP90が急激に発現低下すること、熱刺激によりHSP90発現が減少し、分化とアポトーシスが誘導されることを明らかにしてきた。本研究ではヒトEC細胞の分化・アポトーシス系におけるHSP90の意義を明らかにする目的で、1)G3細胞へのHSP90遺伝子導入による発現増強およびアンチセンスDNAによる発現抑制、2)EC細胞の分化前後でHSP90と分化会合している蛋白質の同定を行なった。その結果、1)HSP90アンチセンスDNAの添加は量依存性にHSP90発現を蛋白質レベルで50%まで抑制し、さらに細胞分化・アポトーシスを誘導した。またG3細胞の栄養膜細胞分化はHSP90β遺伝子導入により著明に阻害された。2)HSP90と共沈する分子を明らかにするため分化誘導前後で抗HSP90抗体を用いた免疫沈降、Western blotを施行したところ、分化誘導前において細胞周期関連蛋白cdc2、非受容体型チロシンキナーゼc-srcとc-fynがHSP90と会合しており、分化誘導後にそれらが解離することが明らかとなった。一方,このような分化誘導前後においてcdc2,c-src蛋白の発現量に変化はなかったが、c-srcのin vitroキナーゼアッセイによって、分化誘導前にキナーゼ活性がより高いことが判明した。これらの結果はHSP90の発現変化が会合する蛋白質の機能を制御し、ヒトEC細胞分化およびアポトーシスの調節に関与していることが示唆するものである。

揭示早期人类胚胎发育的分子机制将不仅对细胞生物学，而且对阐明肿瘤发育机制的贡献。我们确定的人类睾丸混合型胎儿癌细胞系G3具有多能的能力，并且在分化过程中诱导了凋亡。到目前为止，已经揭示了热激蛋白Hsp90的表达在人类EC细胞的早期分化过程中突然降低，并且HSP90的表达由于热刺激而降低，导致分化和凋亡。在这项研究中，我们研究了HSP90在人类EC细胞的分化和凋亡系统中的重要性，以及1）通过将HSP90引入G3细胞中并通过反义DNA抑制表达来增加表达，而2）鉴定出在EC细胞分化之前和之后与HSP90区分开的蛋白质。结果，1）添加Hsp90反义DNA以定量方式在蛋白质水平上抑制了50％的HSP90表达，并进一步诱导细胞分化和凋亡。此外，HSP90β基因转移明显抑制了G3细胞的滋养细胞分化。 2）为了澄清与HSP90共沉淀的分子，使用抗HSP90抗体进行了蛋白质印迹，在分化诱导前后，进行了蛋白质印迹，并且揭示了细胞周期相关的蛋白Cdc2 Cdc2，与HSP90的非受体酪氨酸激酶C-SRC和C-FYN，与HSP90的分化诱导，并在这些差异诱导之后，并以这些这些差异为差异。另一方面，尽管在分化诱导之前和之后，CDC2和C-SRC蛋白的表达水平没有改变，但C-SRC的体外激酶测定表明，激酶活性在诱导分化之前较高。这些结果表明，HSP90表达的变化调节相关蛋白的功能，并参与了人类EC细胞分化和凋亡的调节。