遅発性神経細胞死における免疫・酵素組織化学的研究 -Ca^<2+>-ATPase抗体作製、砂ネズミ後脳虚血実験、リーラーマウス虚血モデルの作製-

延迟性神经细胞死亡的免疫学和酶组织化学研究 - Ca^2+-ATPase抗体制作、沙鼠后脑缺血实验、reeler小鼠缺血模型制作 -

• 批准号: 07771113
• 负责人: 小黒 恵司
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07771113/
• 关键词: 脳虚血; 遅発性神経細胞死; 海馬; Ca^<2+>-ATPase; 免疫組織化学; グルタミン酸受容体

1.原形質膜Ca^<2+>-ATPase抗体の作製、免疫組織化学赤血球膜より蛋白を精製し、抗体作成の予定であったが、効率が悪く、蛋白を得るまでに多大な時間を要するため、以下のような分子生物学的手法により、蛋白を得、抗体を作成した。原形質膜Ca^<2+>-ATPaseにはtypeI-IVのサブタイプがあるが、分子量が約12Kと大きく、蛋白全体として精製することは難しい。従って、各々の活性部位のみを精製し、同部蛋白に対する抗体を作成した。生化学的な分析から、海馬にはtypeIIあるいはIが多く発現していることが予想され、先ず、typeII抗体作製を行った。(方法)(1)原形質膜Ca^<2+>-ATPaseのプローブを入手し、制限酵素を用いてCa^<2+>-ATPase分子を切断、活性部位のみのプローブを作製。(2)得られたプローブをベクターを用いて大腸菌に組み込み、大腸菌を増殖させ、Ca^<2+>-ATPase活性部位蛋白を発現させる。(3)菌体蛋白を可溶化し、ヒスチジンカラムを用いて目的蛋白のみを分離精製。(4)野兎を用いてpolyclonal抗体作製。ウエスタンブロッテイングによる特異性の検定。現在、typell抗体については(4)までを終了し、虚血砂ネズミにおいて免疫組織科学的検討を行っている。尚、以前、本研究費によって行った、同酵素の酵素組織化学的検討の結果をpublishした。2.砂ネズミ後脳虚血モデルの実験砂ネズミの椎骨動脈は非常に細く、確実に閉塞することが難しい。現在、Hataら(1994)の両側鎖骨下動脈閉塞法の手技習熟に努めている。3.リーラーマウス遅発性神経細胞死モデルの作製リーラーマウスの椎骨動脈は砂ネズミよりさらに細く、閉塞はさらに困難である。前記の手技獲得により、4vesseles occulusionを実現したい。4.砂ネズミ海馬スライスを用いた電気生理学的実験本年度は新たに、電気生理学的実験を開始し、遅発性神経細胞死におけるグルタミン酸受容体の関わりを明らかにして行く予定である。

1. Preparation of protoplasma Ca^<2+>-ATPase antibody, purification of erythrocyte membrane protein, determination of antibody preparation, efficiency, protein preparation, molecular biology methods, protein preparation, antibody preparation Prototype Ca^<2+>-ATPase has a molecular weight of about 12K and a total protein content of about 10 K. To purify the active sites and produce antibodies against the same proteins Biochemistry analysis, hippocampus, type II antibody production (Method)(1) The protoplasma Ca^<2 +>-ATPase molecule cleavage and active site cleavage were performed by starting and limiting enzyme. (2)The expression of E. coli, E. coli growth, Ca^<2+>-ATPase active site protein (3)The bacterial protein is solubilized, and the target protein is separated and refined using the CCIS ® Library. (4)Wild animals are made with polyclonal antibodies. It's a very specific test. Now, typell antibody detection (4) has been completed, and the study of immune tissue science has been carried out. The results of histochemical analysis of isoenzymes were published in this study. 2. The vertebral artery of the spinal cord is very fine and accurate. Now, Hata (1994) and the side of the subclavian artery Qian Hongfa hand skills to learn to work hard. 3. It is difficult to control the death of nerve cells in the spinal artery. The previous skill acquisition, 4vesseles occultation, was realized. 4. This year, the development of electrophysiology in the hippocampus has begun. The development of electrophysiology in the hippocampus has begun. The relationship between the development of neurotransmitters and acid receptors has been determined.

项目成果

1)K.Oguro,etc: "Histochemical study of Ca^<2+>-ATPase activity in ischemic CA1 pyr amidal neur ons in gerbil hippocampus" Acta.Neurol.Patho.90. 454-460 (1995)

1)K.Oguro等：“沙鼠海马缺血性CA1锥酰胺神经元Ca^2-ATP酶活性的组织化学研究”Acta.Neurol.Patho.90。

H.Tsubokawa,K.Oguro,etc: "Single glutamte channels in CA1 pyramidal neur ons after transientischemia" Neuro Report. 6. 527-531 (1995)

H.Tsubokawa，K.Oguro等：“短暂性缺血后CA1锥体神经元中的单谷氨酸通道”神经报告。

H.Tsubokawa,K.Oguro,etc: "Effects of a spider toxin and its an alogue on glutamate-activated currents in the hippocampal CA1 nuer on after ischemia" J.Neur ophysiology. 74. 218-225 (1995)

H.Tsubokawa，K.Oguro 等：“蜘蛛毒素及其类似物对缺血后海马 CA1 谷氨酸激活电流的影响”J.神经生理学。

H.Tsubokawa,K.Oguro,etc: "Spontaneous excitatory post synaptic currents in hippocampal CA1 pyramidal neur ons of the gerbil after transient ischemia" Neur oscience Letters. 191. 95-98 (1995)

H.Tsubokawa，K.Oguro等：“短暂性缺血后沙鼠海马CA1锥体神经元的自发兴奋性突触后电流”神经科学快报。