脳虚血による神経細胞障害の分子メカニズムの解析

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一過性虚血再潅流後に変化するタンパク質の解析ラットを用いて30分の一過性虚血後、再潅流し経時的に大脳皮質を採取して細胞分画を行い、核、ミトコンドリア、ミクロソームおよびサイトゾールを調製した。被虚血側および偽手術群を対照として各画分に含まれるタンパク質をSDS-PAGEにより分析したところ、サイトゾール画分において分子量67kDaのタンパク質が顕著に増加しており、その増加パターンは再潅流開始後、16時間および8日にピークを示す二峰性であった。イオン交換カラムTSK DEAE-5PWおよびゲルろ過カラムTSK G3000SWXLを用いた高速液体クロマトグラフィーによりこのタンパク質をSDS-PAGE上単一バンドを示すまでに精製した。精製標品をTPCK-Trypsinで限定分解後、逆相カラムShodexC18-5Bを用いた高速液体クロマトグラフィーによりペプチドマッピングを行い、得られたフラグメントのいくつかについてアミノ酸配列を解析したところ、このタンパク質は血清アルブミンであることが明らかになった。また、ラット全血清を抗原としてウサギ抗血清を作成し、イムノブロット法により分析したところ、アルブミンを含めて8種類の血清由来タンパク質がサイトゾール画分においてアルブミンと同様の増加パターンを示した。さらにヒトトランスフェリンに対する抗血清を作成して同様の分析を行った結果、そのうちの80kDaのタンパク質はトランスフェリンであることが明らかになった。また、作用機序の異なるいくつかの血管透過性抑制剤を用いて同様の分析を行ったが顕著な変化は見られなかった。現在、一過性虚血による血清タンパク質の漏出機構について解析を進めている。