神経網膜におけるフリーラジカル制御機構に対する硝子体手術の影響の解析

玻璃体切除术对神经视网膜自由基控制机制的影响分析

• 批准号: 07771530
• 负责人: 高梨 泰至
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07771530/
• 关键词: 硝子体

(1)研究計画 1.過酸化水素感受性蛍光色素のキャリブレーション 2.網膜細胞内過酸化水素定量 3.光照射による網膜細胞内過酸化水素活性への影響 4.人工潅流液中グルタチオンの網膜保護作用(2)方法 1.過酸化水素感受性蛍光色素のキャリブレーション 過酸化水素感受性蛍光色素には2、7-ジクロロフルオレセイン(DCF)を用いるためフルオロトロンマスター(コヒレント社、現有設備)におけるDCF濃度の測定範囲を10-9-10-5Mの間でキャリブレーションキュベットを用いて蛍光強度を計測する。2.硝子体手 有色家兎(2.3-2.5kg)をミドリンPにて散瞳後、全身麻酔下に硝子体手術を施行。手術用顕微鏡(現有設備)下で開瞼器にて開瞼の後、結膜切開し強膜を露出。輪部より4mmの部位にMVRナイフを用いてinfusion port作成しinfusion tubeを縫合固定。約90度離れた部位にsuction-cutter portを作成しオキュトーム10000(アルコン社、現有設備)を用いて約1分間硝子体切除術施行。硝子体切除後、潅流速度を1.0cc/min. に調節する。3.網膜細胞内過酸化水素定量 網膜細胞内過酸化水素の定量には過酸化水素と反応し蛍光を発する2、7-ジクロロフルオレッセイン(DCF)を指標に用いる。網膜の神経細胞に取り込ませるために、細胞膜を容易に透過するDCFの前駆体、2、7-ジクロロフルオレッシンジアセテート(DCFH-DA)を用いる。硝子体手術後、5オMDCFH-DAにて潅流すると網膜細胞内に拡散したDCFH-DAは細胞内のエステラーゼにより膜を透過しない無蛍光の2、7-ジクロロフルオレッシン(DCFH)に代謝され細胞内にトラップされる。DCFHは細胞内に生じた過酸化水素によって酸化され蛍光を発するDCFになりピコモルレベルの過酸化水素を検出できる。これをフルオロトロンマスター(コヒレント社)を用いて490nmで励起すると520nmにピークを持つ蛍光を発する。これを利用して網膜細胞内過酸化水素活性を定量する。4.光照射負荷 手術顕微鏡による光照射を1800luxおよび3600luxに設定しそれぞれ10分、20分、30分の条件で網膜を照射し、その後の網膜細胞内の過酸化水素活性を定量する。5人工潅流液中グルタチオンの網膜保護作用 対照の潅流液にはBSSを用いる。これに酸化型グルタチオンを添加したBSSplusは角膜保護作用があることは確認されているが、網膜保護作用については明らかではない。網膜細胞内過酸化水素定量により、保護作用の有無を確認する。(3)研究結果 1.通常の硝子体手術野の後30分間の硝子体潅流液潅流では網膜に2.2+1.1 pMDCFが認められたが、30分間の光照射を行うと21.7+4.8pMDCFを認め、これは統計学的に有意であった。2.潅流液に酸化型グルタチオンを投与することにより、網膜内DCFは4.9+4.1pMに抑制され、これは統計学的に有意であった。(4)結論 1.硝子体手術における顕微鏡光刺激により網膜内過酸化水素は有意に増加した。2.潅流液中のGSSGは光刺激による網膜の過酸化を有意に抑制した。3.潅流液中のGSSGは網膜内に移行しGlutathione redox cycleに利用されている可能性が示唆された。

(1)Project 1. Peracidified aqueous-sensitive photochrome 2. Quantification of peracidified aqueous-in retinal cells 3. Effects of light irradiation on peracidified aqueous-in retinal cells 4. Protective effects of peracidified aqueous-sensitive photochrome in artificial fluid 2. Method 1. Peracidified aqueous-sensitive photochrome 2. 7-DCF (DCF) is used to measure the concentration of DCF within a range of 10-9-10-5M. 2. Nitrate surgery is performed under general anesthesia after mydriasis. Under the operating microscope (existing equipment), the eyelid speculum is opened and the conjunctiva is opened to expose the strong membrane. The MVR tube is made of infusion port and sutured at the 4mm position of the wheel. About 90 degrees away from the site, the suction-cutter port was made to 10000(with existing equipment), and the nitrectomy was performed in about 1 minute. After removal of nitrate, the flow rate is adjusted to 1.0cc/min. 3. Quantification of peracidified water in retinal cells Quantification of peracidified water in retinal cells is used as an indicator of peracidified water and fluorescence (DCF). The membrane of retinal neurons is easily permeable to DCF precursors, 2,7-difluorophos (DCFH-DA). After nitrate surgery, 5-D CFH-DA metabolism was observed in retinal cells and 2, 7-D CFH-DA metabolism was observed in retinal cells. DCFH produces intracellular peracidified water molecules, which can be detected by DCF. The wavelength of the laser beam is 490nm and the wavelength of the laser beam is 520nm This method was used to quantify intracellular peracidifying hormone activity in retina. 4. The light irradiation load was set at 1800lux to 3600lux for surgical microscopes, and was measured at 10 min, 20 min, and 30 min for retinal cells. 5. The protective effect of artificial fluid on retina against BSS The addition of BSSplus to the cornea confirms the protective effect of the retina. Quantification of intracellular hyperacidity and confirmation of its protective effect (3)Results 1. Nitrate flow in the last 30 minutes of the normal nitrate surgical field was 2.2+1.1 pMDCF in the retina and 21.7+ 4.8 pMDCF in the 30 minutes of light irradiation. 2. Acidification of the flow pattern was inhibited by DCF 4.9+4.1pM in the retina, which was statistically significant. (4)Conclusion 1. Microscopic light stimulation during nitrate surgery increases the amount of hyperacidified water in retina. 2. GSSG in fluid is inhibited intentionally by photostimulation and by retinal acidification. 3. The possibility of GSSG migration in the retina and utilization of Glutathione reduction cycle is demonstrated.