抗原と抗体の特異的結合に関与する立体構造の同定

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本研究の最終的な目標は、巨大蛋白質間の特異的相互作用を規定する立体構造の解明であるが、そのために、未変性のll型コラーゲンの三重ら旋構造に表現される立体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体(mAb)と本mAbに対する抗イディオタイプ抗体を材料にとり、両者の特異的結合に関与する高次構造を、核磁気共鳴(NMR)とX線結晶構造解析で検討するものである。本年度の研究において以下の成果を得ることができた。(1)NMRやX線解析等の解析法を可能ならしめる材料として、まず、上記2種のmAbの抗原結合活性を保持した最小単位であるFvの遺伝子工学的発現系を確立した。(2)発現させた単鎖Fvが、元のmAbと正しく同じ抗原特異性とイディオタイプを示すことを免疫化学的に確認した。(3)発現タンパク(単鎖Fv抗体)は宿主大腸菌細胞の封入体内に多量に蓄積することがわかったため、封入体から変性状態で単鎖Fv抗体を取り出した後、人為的な巻戻しによって、活性を持った単鎖Fv抗体を調節する方法を確立した。この後、イオン交換クロマトグラフィーを行うことで、結晶化が供しうる高純度かつ高濃度の標品を調製することが可能になった。(4)ハンギングドロップ法を用いて、各単鎖Fv抗体および両者の免疫複合体の結晶を得るための、タンパク質濃度、pH、塩濃度、塩(沈殿剤)の種類の諸条件を検討した。小さな結晶の形成を認める条件が明らかになったが、X線解析に耐えうる、直径0.3mm以上の結晶を得るまでには至っていない。現在、結晶の成長をうながす諸条件を検討中である。(5)精製した単鎖Fv抗体を一次元^1H-NMRで解析したところ^1Hを利用して十分な情報を得るのは困難と判断されたため、^<13>Cを用いた標識NMRにて解析することとし、標識条件を決定した。