抗原と抗体の特異的結合に関与する立体構造の同定

鉴定参与抗原和抗体特异性结合的三维结构

• 批准号: 07857135
• 负责人: 伊藤 博夫
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07857135/
• 关键词: モノクローナル抗体; 抗体イディオタイプ抗体; 単鎖Fv抗体; 高次構造; ll型コラーゲン; 核磁気共鳴(NMR); X線結晶構造解析; 巻戻し

本研究の最終的な目標は、巨大蛋白質間の特異的相互作用を規定する立体構造の解明であるが、そのために、未変性のll型コラーゲンの三重ら旋構造に表現される立体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体(mAb)と本mAbに対する抗イディオタイプ抗体を材料にとり、両者の特異的結合に関与する高次構造を、核磁気共鳴(NMR)とX線結晶構造解析で検討するものである。本年度の研究において以下の成果を得ることができた。(1)NMRやX線解析等の解析法を可能ならしめる材料として、まず、上記2種のmAbの抗原結合活性を保持した最小単位であるFvの遺伝子工学的発現系を確立した。(2)発現させた単鎖Fvが、元のmAbと正しく同じ抗原特異性とイディオタイプを示すことを免疫化学的に確認した。(3)発現タンパク(単鎖Fv抗体)は宿主大腸菌細胞の封入体内に多量に蓄積することがわかったため、封入体から変性状態で単鎖Fv抗体を取り出した後、人為的な巻戻しによって、活性を持った単鎖Fv抗体を調節する方法を確立した。この後、イオン交換クロマトグラフィーを行うことで、結晶化が供しうる高純度かつ高濃度の標品を調製することが可能になった。(4)ハンギングドロップ法を用いて、各単鎖Fv抗体および両者の免疫複合体の結晶を得るための、タンパク質濃度、pH、塩濃度、塩(沈殿剤)の種類の諸条件を検討した。小さな結晶の形成を認める条件が明らかになったが、X線解析に耐えうる、直径0.3mm以上の結晶を得るまでには至っていない。現在、結晶の成長をうながす諸条件を検討中である。(5)精製した単鎖Fv抗体を一次元^1H-NMRで解析したところ^1Hを利用して十分な情報を得るのは困難と判断されたため、^<13>Cを用いた標識NMRにて解析することとし、標識条件を決定した。

The ultimate goal of this study is to define the specific interaction between giant proteins, and to characterize the three-fold structure of the protein. The antibody (mAb) and the mAb are related to the specific binding of the protein to the higher order structure. Nuclear magnetic resonance (NMR) and X-ray crystal structure analysis are discussed in detail. This year's research results include: (1)NMR, X-ray analysis and other analytical methods have been used to establish a molecular engineering system that can maintain the antigen-binding activity of the two mAbs listed above at a minimum level. (2)The discovery of Fv, mAb, and antigen specificity was confirmed by immunochemistry. (3)A method for detecting and regulating the activity of a single Fv antibody after isolation from a host E. coli cell in a high volume and in a stable state was established. After this, the exchange rate is increased, and the crystallization rate is increased. (4)The conditions for the crystallization of the immune complex of each individual Fv antibody, the concentration of the antibody, pH, concentration of the antibody, and the type of the antibody were discussed. The conditions for the formation of small crystals are as follows: light, X-ray analysis, resistance, crystal diameter of 0.3 mm or more. The conditions for the growth of crystals are discussed. (5)1H-NMR is used to determine the difficulty of identification<13>.