タンパク質の高次構造に依存する抗原エピトープ同定法の開発

开发依赖于蛋白质构象的抗原表位识别方法

• 批准号: 08877282
• 负责人: 伊藤 博夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877282/
• 关键词: タンパク質の高次構造; 抗イディオタイプ抗体; リコンビナント単鎖Fv抗体; エピトープ; II型コラーゲン; ホモロジーモデリング; 核磁気共鳴(NMR); タンパク質の結晶化

タンパク質の高次構造に依存するB細胞抗原エピトープの実体を解明するための方法論の確立を目指して本研究を遂行した。実験材料として、未変性II型コラーゲンに表現される高次構造をエピトープとして認識するマウスモノクローナル抗体(mAb1)と、mAb1に対する抗イディオタイプ抗体(mAb2;mAb1が認識するII型コラーゲンの高次構造依存性エピトープを模倣することが示唆されている)に由来するリコンビナント単鎖Fv抗体を用い、両者の結合に関わる因子を解析した。両抗体は互いの重鎖V領域と軽鎖V領域の両者からなるタンパク質の高次(四次)構造を認識し合うものであることが判明した。両抗体間の相互作用をホモロジーモデリングにより分析した結果、結合面中央における静電相互作用、および周縁部の芳香環同士の疎水性相互作用によって、両抗体が結合する様式が示唆された。相互作用に関与すると考えられるアミノ酸残基は、MAb1,mAb2共に、重鎖と軽鎖の両方の多数のCDR領域に分布していた。コラーゲン分子のホモロジーモデリングを行ったところ、さらに精密な結合様式に関する情報が、エピトープ候補部位を絞り込むために必要と判断された。そこで、精製Fv抗体のNMRによる解析を行った。最初に一次元^1H-NMRでの解析を行ったが、^1Hの利用により十分な情報を得るのは困難と判断した。そこでCDR領域にある各Fvのメチオニン残基に注目して、まずmAb1-Fvへのメチオニン側鎖特異的^<13>C標識法の諸条件を決定し、^<13>C-NMR測定を行った結果、本法がFv抗体の結合様式を解析するために有効であることが明らかになった。また、各Fv抗体および両者の免疫複合体の結晶化を試みた。これまでのところmAb1-Fvと複合体の結晶化には成功していないが、mAb2-Fvの微小結晶が得られたので、この条件を元にX線解析の測定に用いうる大きさまで結晶を成長させる条件を検討している。

タ ン パ tectonic に ク の high quality time dependent す る B cell antigen エ ピ ト ー プ の be body を interpret す る た め の の methodology established を refers し て を carries out this study し た. Be 験 material と し て, not - type II コ ラ ー ゲ ン に performance さ れ る high secondary tectonic を エ ピ ト ー プ と し て know す る マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル antibodies (mAb1) と, mAb1 に す seaborne る resistance イ デ ィ オ タ イ プ antibodies (mAb2; MAb1 が know す る II コ ラ ー ゲ ン の high order structural dependence エ ピ ト ー プ を imitate す る こ と が in stopping さ れ て い る) に origin す る リ コ ン ビ ナ ン ト 単 lock を Fv antibody with い, struck の combining に masato わ る factor analytical し を た. Struck antibody は mutual い の heavy lock V field と 軽 の lock V field that struck the か ら な る タ ン パ ク の high quality time (four) tectonic を understanding し matched う も の で あ る こ と が.at し た. の interaction between antibodies that struck を ホ モ ロ ジ ー モ デ リ ン グ に よ り analysis し た results, combined with the central に お け る electrostatic interaction, お よ び week try department の aromatic ring with James の 疎 water-based interaction に よ っ て, struck antibody が combining す る others type が in stopping さ れ た. Interaction に masato and す る と exam え ら れ る ア ミ ノ acid residues は, MAb1 mAb2 に, heavy lock と 軽 lock の struck party の most の に CDR field distribution し て い た. コ ラ ー ゲ ン molecular の ホ モ ロ ジ ー モ デ リ ン グ を line っ た と こ ろ, さ ら に precision な combined with others in type に masato す る intelligence が, エ ピ ト ー プ alternate parts を ground り 込 む た め に と judgment necessary さ れ た. Youdaoplaceholder0 で で, refined Fv antibody <s:1> NMRによる analysis を line った. Initial に a yuan ^ 1 h-nmr で の parsing line を っ た が, ^ 1 h の using に よ り very な intelligence を る の は difficult と judgment し た. そ こ で CDR field に あ る the Fv の メ チ オ ニ ン residues に attention し て, ま ず mAb1 - Fv へ の メ チ オ ニ ン side chain specific ^ < 13 > C identification method の conditions を decided し, ^ < > 13 C - NMR measurement line を っ た results, this law が の Fv antibody combined with others in type を parsing す る た め に have sharper で あ る こ と が Ming ら か に な っ Youdaoplaceholder0. Youdaoplaceholder0, each Fv antibody および, <s:1> immune complex <e:1> crystallization を test みた. こ れ ま で の と こ ろ mAb1 - Fv と complex の crystallization に は successful し て い な い が, mAb2 Fv の tiny crystals が have ら れ た の で, こ の conditions を yuan に に measure X-ray analytical の い う る big き さ ま で crystallization を growth さ せ る conditions を beg し 検 て い る.

项目成果

Ito,H.-O.: "Prevention of collagen-induced arthritis by treatment with polythylene glycol-conjugated type II collagen ; district tolerogenic property of the・・・" Clin.Exp.Immunol.(in press). (1997)

Ito, H.-O.：“通过聚乙二醇缀合的 II 型胶原蛋白治疗预防胶原蛋白诱发的关节炎；……的区域耐受性”Clin.Exp.Immunol.（出版中）。

Ito,H.-O.: "Quaternary structure-dependent idiotope and antigen binding of a monoclonal antibody specific for conformational epitope on type II collagen." Cell.Mol.Life Sci.(formerly Experientia). 53. 51-60 (1997)

Ito,H.-O.：“四级结构依赖的独特位点和对 II 型胶原构象表位具有特异性的单克隆抗体的抗原结合。”