ヒト毛細胞特異的ペプチジルアルギニンデイミナーゼのcDNAクローニングと機能解析

人毛细胞特异性肽基精氨酸脱亚氨酶的cDNA克隆及功能分析

• 批准号: 08660087
• 负责人: 高原 英成
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Ibaraki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08660087/
• 关键词: ペプチジルアルギニンデイミナーゼ; ヒト毛細胞; cDNAクローニング; アイソタイプT4; 免疫細胞化学; RT-PCR; 3'-RACE; 5'-RACE

蛋白質のArg残基をCit残基に変換する酵素はペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PADと略記)と呼ばれ、細胞の終末分化に関与していることが示唆されている.同酵素には組織分布が異なる3つのアイソタイプ(Type I,II,III)が存在することが知られているが,我々は最近新規なアイソタイプ(PAD T4)がラット毛嚢細胞に存在することを見出した.PAD T4は毛細胞の分化に重要な機能を果たしていることが推測されることから、本研究をより実用的な研究に発展させるためにはヒト毛細胞のPAD T4のcDNAクローニングが不可欠と判断し、以下に述べる研究ならびに成果を得た.手術摘出ヒト頭皮組織から毛嚢組織を分離し、Y.Okanoらの初代培養法により培養後、poly(A)^+mRNAを調製、次いでrandom primer法により一本鎖cDNAを合成した.これを鋳型としてラットPAD T4の塩基配列に基づくホモログRT-PCR法により翻訳領域のcDNAを増幅した.つぎに、未決定の3'並びに5'非翻訳領域についてはRACE法によりcDNAを増幅することが出来、これら増幅cDNAをT-plasmidにクローニングし、得られたクローンの塩基配列を分析した.その結果、ヒトPAD T4 cDNAは41bpの5'非翻訳、1,995bpの5'翻訳、1,147bpの3'非翻訳領域から構成されていることが明らかとなった.本酵素は664アミノ酸残基、分子量は74,770、等電点は5.20と推定され、また本cDNAを大腸菌で発現させた結果、大腸菌抽出液にPAD活性が見出されたことから、本cDNAが間違いなくヒトPAD T4をコードするものであることが明らかとなった.さらに、ヒト皮膚における本酵素の局在性を調べるために、推定アミノ酸配列を基に抗ペプチド抗体を作製し、ヒト皮膚切片の免疫組織化学を行った、その結果PAD T4は外毛根鞘の内毛根鞘に接する細胞に局在することが明らかとなった.現在、さらにPADT4の生理機能を明らかにするため、ヒト頭皮毛疾患組織標本について免疫組織化学的研究を進めている.

Protein Arg residues and Cit residues are replaced by enzymes and enzymes. Terminal differentiation of cells is related to the type (PAD T4) The presence of hairy cells is revealed.PAD The differentiation of T4 hair cells is important and the function of the results is speculated.ら、The research used in this study is the に発Developmentさせるためにはヒトhair cell のPAD T4's cDNA test results cannot be judged. The results of the following research are as follows. The scalp tissue is surgically removed and the hair is removed. Tissue separation, Y.Okano primary culture method, post-culture, poly(A)^+mRNA preparation, sub-random The primer method is a one-stop cDNA synthesis method. The primer type is used to synthesize PAD. T4 base alignment method and RT-PCR method using cDNA in the field of translation Undecided 3' and 5' non-translation area についてはRACE methodりcDNAをincreased することが出, これらincreased cDNAをT-plasmidにクローニングし, られたクローンの塩塩综合をanalytic した.その results, ヒトPAD T4 cDNA has 41 bp of 5' non-translation, 1,995 bp of 5' non-translation, and 1,147 bp of 3' non-translation. The translation field is composed of 664 アミノ acid residues and molecular weight. 74,770, isoelectric point 5.20 and estimated The PAD activity of the coliform extract liquid and the cDNA of this cDNA are shown in the PAD activity. T4をコードするものであることが明らかとなった.さらに、ヒトSKIN におけるThe nature of this enzyme is を Adjustment べるために、Presumed アミノ acid ligated を-based anti-ペプチド antibody を production し、ヒト skin section immunohistochemistry をった、その results PAD T4's outer hair root sheath's inner hair root sheath's connection to the cells' location is in the することが明らかとなった.Now, it's PADT4のphysiological function を明らかにするため、ヒトThe study of immunohistochemistry of scalp hair disease tissue specimens を进めている.

项目成果

Takayuki Nishijo ら: "Isolation and Moleoular Cloning of Epidermal-and Hair Fallicle-Specitic Peptidylarginine Deiminase (Type III) from Rat" The Journal of Biochemistry. 121・5.

Takayuki Nishijo 等人：“大鼠表皮和毛囊特异性肽酰精氨酸脱亚胺酶（III 型）的分离和分子克隆”《生物化学杂志》121・5。