大腸菌発現系による蛋白質アルギニン脱イミノ酵素の特性解析と高機能キメラ酵素の創製

使用大肠杆菌表达系统表征蛋白质精氨酸脱亚胺酶并创建高功能嵌合酶

• 批准号: 07660090
• 负责人: 高原 英成
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Ibaraki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07660090/
• 关键词: 蛋白質アルギニン脱イミノ酵素; 遺伝子組換え型酵素; 高機能キメラ酵素; Two-Cistron発現ベクター; フィラグリン; トリコヒアリン; トランスグルタミナーゼ; エキソンマップ

蛋白質中のArg残基をCa2^+依存的に脱イミノ化しCit残基に変換するPeptidylarginine deiminase(PAD)にはアイソフォームtype I,II,IIIが存在する。これらの内typeIとIIIは表皮・毛嚢に特異的であるが、その酵素化学的性質は殆ど不明である。先に我々は、新生児ラット表皮からPADtypeIおよびIIIのcDNAクローニングに成功し、その全一次構造を決定した。本研究では、未だ不明のPADtypeIおよびIIIの酵素化学的諸性質を明らかにするため、これらcDNAの大腸菌発現系と発現酵素の精製法を確立した。PADtypeI,IIIcDNAの翻訳領域にフレームが合うよう制限酵素EcoRIならびにHindIIIサイトを付与したプライマーを合成、上述cDNAを鋳型としてPCRにより翻訳領域を増幅、この増幅DNAを発現ベクターpKK223-3のEcoRI-HindIIIサイト間に挿入した。PCR増幅に伴う塩基変異がそれぞれ3カ所存在したが、これらはもとのcDNAと入れ替えることで解決した。本発現ベクターは我々が開発したTwo-Cistron発現ベクターであり、IPTGにより菌体可溶性全蛋白質の約5%を誘導合成させることができた。つぎに発現酵素の精製は、30-50%硫安塩析、無坦体等電点電気泳動法、ついで大豆Kunitz型trypsin inhibitorをリガンドとする親和性クロマトグラフィーによりほぼ単一まで純化する方法を確立した。これらの精製組換え酵素についてその酵素化学的諸性質を調べた。特に、表皮ならびに毛嚢ケラチン結合蛋白質として知られるフィラグリンおよびトリコヒアリンに対する反応性について検討した結果、PADtypeIはフィラグリンに対し、またtypeIIIはトリコヒアリンに対し極めて高い反応性を示し、さらにこれらの蛋白質は修飾に伴いトランスグルタミナーゼによる架橋反応が著しく促進されることが見出された。これらの知見は上記PADの機能を推測する上で極めて重要な発見である。さらに本研究ではPADtypeI,III遺伝子のエキソンマップを解析し、両遺伝子がすでに明らかにしているPADtypeII遺伝子と同様16個のエキソンから構成されることが判った。現在、各ドメイン毎の大腸菌発現系を構築し、発現ドメイン蛋白質の機能解析を進めているが、今後各機能ドメインを相互交換し高機能キメラ酵素を創製したい。

Arg residue Ca2 ^ +-dependent debonding of Cit residue Peptidylarginine deiminase (PAD), Peptidylarginine deiminase (PAD). The chemical properties of typeI III epidermis hairs are almost unknown. First of all, let's make a decision on the success of the new baby, the epidermis, the PADtypeI, the III, the cDNA, the success and the decision. In this study, we did not know the nature of the enzyme chemistry of PADtypeI, cDNA, and cDNA. The method of enzyme purification was confirmed. PADtypeI,IIIcDNA reverses the domain. The restriction enzyme EcoRI, the HindIII, the synthesis, the cDNA, the PCR, the domain, the DNA, the pKK223-3, the EcoRI-HindIII, the synthesis, the output, the output, the size, the size, In the PCR frame, if there is an error in the database, the cDNA will be replaced by the solution. In this paper, we use Two-Cistron to synthesize the total soluble protein of bacteria, which is about 5% of the total soluble protein of IPTG. Enzyme analysis, 30-50% thioampere analysis, soy body swimming, soybean Kunitz trypsin inhibitor swimming, and sex testing. The nature of enzyme chemistry is very important in enzyme chemistry. Special, epidermis, hair, hair, protein, protein, protein and protein. This is the best way to make sure that you have a problem with the protein. Please tell me that the PAD machine will be able to recommend you to make important comments. In this study, both PADtypeI,III and PADtypeII sub-test data were analyzed and analyzed, and the results of the 16-year-old were analyzed. At present, all kinds of bacteria are used in the laboratory, the protein machine can be analyzed, and in the future, all the machines will be able to communicate with each other, and the enzyme enzyme will be used in the future.