ヒトGHRH受容体遺伝子の構造とその発現調節機構の解析

人GHRH受体基因结构分析及其表达调控机制

• 批准号: 08671159
• 负责人: 置村 康彦
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08671159/
• 关键词: GHRH受容体遺伝子; Pit-1; 転写調節; 成長ホルモン; 下垂体

1.ヒト成長ホルモン放出ホルモン受容体(GHRHR)遺伝子のクローニング既知のGHRHR遺伝子のコーディング領域に続くGHRHR遺伝子5'上流配列(約6k)をクローニングし、翻訳開始点より2.7kまでのシークエンスをした。さらに、ヒト下垂体mRNAを用いて、primer extension法、RNase protection法により転写開始点の決定を試みた。その結果、翻訳開始点より130bp上流が主な転写開始点と考えられた。5'RACE法を使用して、5'非翻訳領域を増幅したところ、翻訳開始点より130bp上流まで伸びた。そのフラグメントのシークエンスを行ったところ、その塩基配列はクローニングしたGHRHR遺伝子の翻訳開始点の上流とまったく一致しており、既知のGHRHR遺伝子のコーディング領域の上流には未知のイントロンはなく、130bp上流が転写開始点と考えられた。このGHRHR遺伝子5'上流配列には典型的なTATAboxはなかったが、GHおよびPRL産生細胞特異的な転写因子であるPit-1の結合配列様塩基配列が9箇所認められた。2.ルシフェラーゼアッセイによるGHRHR遺伝子5'上流配列の機能解析上記のGHRHR遺伝子5'上流配列を順次、切断し、それぞれにルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーター遺伝子を作製した。これをGH、PRLを産生するGH_3細胞(GHRHRは下垂体GH産生細胞に発現しているため、この細胞株を用いた)にトランスフェクトした後、GH_3細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、翻訳開始点から14lbp上流までデリーションしたときは、活性が保たれているが、90bpまでデリーションしたときには、活性が著減することが明らかになった。この結果はGHRHR遺伝子の構造解析成績とよく合致した。一方、GH_3細胞で活性を発揮するレポーター遺伝子をCos細胞およびHela細胞にトランスフェクトしたときには、ルシフェラーゼ活性は全く検出し得なかった。しかし、同時にPit-1 を発現させてみると、ルシフェラーゼ活性は明らかに検出され、Pit-1 がGHRHR遺伝子の組織特異的発現を規定することが明らかになった。

1. GHRHR receptor (GHRHR) gene expression domain: GHRHR gene expression domain: GHRHRgene expression domain: GHRgene expression domain: GHRHRgene expression domain: GHRHRgene expression In this paper, we use primer extension method, RNase protection method to determine the starting point of transcription. The result, the start point of the translation, is 130bp. 5'RACE method is used to increase the amplitude of 5' non-inverted domain, and the inversion start point is 130bp. GHRR gene translation start point upstream and downstream of GHRR gene translation start point upstream of GHRR gene translation start point of GHR The 5'upstream alignment of the GHRHR gene is typical of the 9-digit alignment of the Pit-1 binding motif of GH and PRL producing cell-specific transcription factors. 2. Function analysis of 5'upstream arrangement of GHRHR gene on GHRHR gene 5' upstream arrangement in sequence, cut off, and combine with GHRHR gene 5'upstream arrangement. The activity of GH and PRL in GH_3 cells was determined after GH and PRL production in GHRHR. The result is that the starting point of inversion is 14 bp, the activity is 90bp, and the activity is 90bp. The results of the structural analysis of the GHRHR gene are consistent with each other. The activity of GH_3 cells was detected in Cos cells and Hela cells. Pit-1 and tissue-specific expression of GHRHR gene are regulated in the following ways: