ヒトGHRH受容体遺伝子の構造とその発現調節機構の解析

1.ヒト成長ホルモン放出ホルモン受容体(GHRHR)遺伝子のクローニング既知のGHRHR遺伝子のコーディング領域に続くGHRHR遺伝子5'上流配列(約6k)をクローニングし、翻訳開始点より2.7kまでのシークエンスをした。さらに、ヒト下垂体mRNAを用いて、primer extension法、RNase protection法により転写開始点の決定を試みた。その結果、翻訳開始点より130bp上流が主な転写開始点と考えられた。5'RACE法を使用して、5'非翻訳領域を増幅したところ、翻訳開始点より130bp上流まで伸びた。そのフラグメントのシークエンスを行ったところ、その塩基配列はクローニングしたGHRHR遺伝子の翻訳開始点の上流とまったく一致しており、既知のGHRHR遺伝子のコーディング領域の上流には未知のイントロンはなく、130bp上流が転写開始点と考えられた。このGHRHR遺伝子5'上流配列には典型的なTATAboxはなかったが、GHおよびPRL産生細胞特異的な転写因子であるPit-1の結合配列様塩基配列が9箇所認められた。2.ルシフェラーゼアッセイによるGHRHR遺伝子5'上流配列の機能解析上記のGHRHR遺伝子5'上流配列を順次、切断し、それぞれにルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーター遺伝子を作製した。これをGH、PRLを産生するGH_3細胞(GHRHRは下垂体GH産生細胞に発現しているため、この細胞株を用いた)にトランスフェクトした後、GH_3細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、翻訳開始点から14lbp上流までデリーションしたときは、活性が保たれているが、90bpまでデリーションしたときには、活性が著減することが明らかになった。この結果はGHRHR遺伝子の構造解析成績とよく合致した。一方、GH_3細胞で活性を発揮するレポーター遺伝子をCos細胞およびHela細胞にトランスフェクトしたときには、ルシフェラーゼ活性は全く検出し得なかった。しかし、同時にPit-1 を発現させてみると、ルシフェラーゼ活性は明らかに検出され、Pit-1 がGHRHR遺伝子の組織特異的発現を規定することが明らかになった。

1.ヒト成長ホルモン放出ホルモン受容体(GHRHR)遺伝子のクローニング既知のGHRHR遺伝子のコーディング領域に続くGHRHR遺伝子5'上流配列(約6k)をクローニングし、翻訳開始点より2.7kまでのシークエンスをした。さらに、ヒト下垂体mRNAを用いて、primer extension法、RNase protection法により転写開始点の決定を試みた。その結果、翻訳開始点より130bp上流が主な転写開始点と考えられた。5'RACE法を使用して、5'非翻訳領域を増幅したところ、翻訳開始点より130bp上流まで伸びた。そのフラグメントのシークエンスを行ったところ、その塩基配列はクローニングしたGHRHR遺伝子の翻訳開始点の上流とまったく一致しており、既知のGHRHR遺伝子のコーディング領域の上流には未知のイントロンはなく、130bp上流が転写開始点と考えられた。このGHRHR遺伝子5'上流配列には典型的なTATAboxはなかったが、GHおよびPRL産生細胞特異的な転写因子であるPit-1の結合配列様塩基配列が9箇所認められた。2.ルシフェラーゼアッセイによるGHRHR遺伝子5'上流配列の機能解析上記のGHRHR遺伝子5'上流配列を順次、切断し、それぞれにルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーター遺伝子を作製した。これをGH、PRLを産生するGH_3細胞(GHRHRは下垂体GH産生細胞に発現しているため、この細胞株を用いた)にトランスフェクトした後、GH_3細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果、翻訳開始点から14lbp上流までデリーションしたときは、活性が保たれているが、90bpまでデリーションしたときには、活性が著減することが明らかになった。この結果はGHRHR遺伝子の構造解析成績とよく合致した。一方、GH_3細胞で活性を発揮するレポーター遺伝子をCos細胞およびHela細胞にトランスフェクトしたときには、ルシフェラーゼ活性は全く検出し得なかった。しかし、同時にPit-1 を発現させてみると、ルシフェラーゼ活性は明らかに検出され、Pit-1 がGHRHR遺伝子の組織特異的発現を規定することが明らかになった。