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Pit1と協同してプロラクチン遺伝子の発現を促進する因子の同定

与Pit1配合鉴定促进催乳素基因表达的因素

基本信息

批准号：
06807083
负责人：
置村康彦
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06807083/
关键词：
プロラクチン遺伝子 Pit1 Oct1 下垂体転写因子

项目摘要

本研究の目的は、Pit1と協同してPRL遺伝子の発現を促進する未知の因子を同定することであった。まず、この未知の因子が、PRL遺伝子のPit1結合DNA配列と直接作用するのか否か検討した。酵母の転写因子であるGal4のDNA結合ドメインにPit1を結合させたフュージョン蛋白の発現ベクターと,Gal4結合DNA配列をもつレポーター遺伝子とをCos細胞にトランスフェクトしたとき、cAMPによって、レポーター遺伝子の活性化は認められなかった。一方、Gal4のDNA結合ドメインにCREBを結合させたフュージョン蛋白の発現ベクターを用いて対照実験を行ったところ、cAMP刺激によって、Gal4レポーター遺伝子は活性化された。以上の成績は、Pit1存在下に起こる、cAMPによる未知の因子を介する遺伝子の活性化には、Pit1結合DNA配列が必要であることを示している。即ち、この未知の因子は直接Pit1結合DNA配列に結合する可能性が示唆された。そこで、実際にPit1結合DNA配列にCos細胞核抽出物が結合するか検討した。Cos細胞から核蛋白を調製し、P1(PRL遺伝子で最も転写開始点に近いPit1結合DNA配列)をプローベとして、mobility shift assayを行ったところ、2本のバンドが認められた。両者とも過剰量のコールドP1を加えた時、認められなくなったことから、Pit1結合DNA配列に特異的な結合蛋白であると考えられた。Pit1以外に、種々の細胞に存在する転写因子であるOct1が、P1に結合することが知られているので、Oct1抗体をこの系に加えたところ、移動度の遅いバンドは消失したが、移動度の早いバンドに変化はみられなかった。Pit1抗体の添加では、どちらのバンドも影響を受けなかった。以上の結果から、Pit1でもOct1でもない未知の蛋白がPit1結合DNA配列に特異的に結合することが示された。現在、この蛋白をクローニングすることを目的に、P1をプローベとして、サウスウェスタン法で,Cos細胞cDNA Libraryをスクリーニング中である。

The purpose of this study is to promote the development of PRL gene by unknown factors. This paper discusses whether the Pit1 binding DNA sequence of PRL gene directly acts on the unknown factors. Yeast DNA binding factor Gal4 binds to Pit1 and protein development,Gal4 binds to DNA alignment and protein activation in Cos cells. One side, Gal4 DNA binding protein CREB binding protein expression in the middle of the reaction, cAMP stimulation in the reaction, Gal4 protein activation The above results indicate that Pit1 binding to DNA is necessary for activation of DNA in the presence of cAMP and unknown factors. That is, this unknown factor is not directly associated with Pit1 DNA alignment. In fact, Pit1 binds to DNA alignment and Cos nuclear extract binding. Cos cell nuclear protein modulation, P1(PRL gene is the most important start point in the middle of the Pit1 binding DNA alignment), mobility shift assay, line, 2, the original point of recognition. P1 binding protein binding protein In addition to Pit1, the presence of a cell in the cell is a factor that increases the mobility of the cell in the cell, increases the mobility of the cell in the cell, and decreases the mobility of the cell in the cell. Pit1 antibody addition is affected by the presence of the antibody. The above results show that Pit1 binds to an unknown protein and Pit1 binds to a specific DNA sequence. Now, in this article, we will discuss the Cos Cell cDNA Library in detail.