Pit1と協同してプロラクチン遺伝子の発現を促進する因子の同定

本研究の目的は、Pit1と協同してPRL遺伝子の発現を促進する未知の因子を同定することであった。まず、この未知の因子が、PRL遺伝子のPit1結合DNA配列と直接作用するのか否か検討した。酵母の転写因子であるGal4のDNA結合ドメインにPit1を結合させたフュージョン蛋白の発現ベクターと,Gal4結合DNA配列をもつレポーター遺伝子とをCos細胞にトランスフェクトしたとき、cAMPによって、レポーター遺伝子の活性化は認められなかった。一方、Gal4のDNA結合ドメインにCREBを結合させたフュージョン蛋白の発現ベクターを用いて対照実験を行ったところ、cAMP刺激によって、Gal4レポーター遺伝子は活性化された。以上の成績は、Pit1存在下に起こる、cAMPによる未知の因子を介する遺伝子の活性化には、Pit1結合DNA配列が必要であることを示している。即ち、この未知の因子は直接Pit1結合DNA配列に結合する可能性が示唆された。そこで、実際にPit1結合DNA配列にCos細胞核抽出物が結合するか検討した。Cos細胞から核蛋白を調製し、P1(PRL遺伝子で最も転写開始点に近いPit1結合DNA配列)をプローベとして、mobility shift assayを行ったところ、2本のバンドが認められた。両者とも過剰量のコールドP1を加えた時、認められなくなったことから、Pit1結合DNA配列に特異的な結合蛋白であると考えられた。Pit1以外に、種々の細胞に存在する転写因子であるOct1が、P1に結合することが知られているので、Oct1抗体をこの系に加えたところ、移動度の遅いバンドは消失したが、移動度の早いバンドに変化はみられなかった。Pit1抗体の添加では、どちらのバンドも影響を受けなかった。以上の結果から、Pit1でもOct1でもない未知の蛋白がPit1結合DNA配列に特異的に結合することが示された。現在、この蛋白をクローニングすることを目的に、P1をプローベとして、サウスウェスタン法で,Cos細胞cDNA Libraryをスクリーニング中である。

本研究の目的は、Pit1と協同してPRL遺伝子の発現を促進する未知の因子を同定することであった。まず、この未知の因子が、PRL遺伝子のPit1結合DNA配列と直接作用するのか否か検討した。酵母の転写因子であるGal4のDNA結合ドメインにPit1を結合させたフュージョン蛋白の発現ベクターと,Gal4結合DNA配列をもつレポーター遺伝子とをCos細胞にトランスフェクトしたとき、cAMPによって、レポーター遺伝子の活性化は認められなかった。一方、Gal4のDNA結合ドメインにCREBを結合させたフュージョン蛋白の発現ベクターを用いて対照実験を行ったところ、cAMP刺激によって、Gal4レポーター遺伝子は活性化された。以上の成績は、Pit1存在下に起こる、cAMPによる未知の因子を介する遺伝子の活性化には、Pit1結合DNA配列が必要であることを示している。即ち、この未知の因子は直接Pit1結合DNA配列に結合する可能性が示唆された。そこで、実際にPit1結合DNA配列にCos細胞核抽出物が結合するか検討した。Cos細胞から核蛋白を調製し、P1(PRL遺伝子で最も転写開始点に近いPit1結合DNA配列)をプローベとして、mobility shift assayを行ったところ、2本のバンドが認められた。両者とも過剰量のコールドP1を加えた時、認められなくなったことから、Pit1結合DNA配列に特異的な結合蛋白であると考えられた。Pit1以外に、種々の細胞に存在する転写因子であるOct1が、P1に結合することが知られているので、Oct1抗体をこの系に加えたところ、移動度の遅いバンドは消失したが、移動度の早いバンドに変化はみられなかった。Pit1抗体の添加では、どちらのバンドも影響を受けなかった。以上の結果から、Pit1でもOct1でもない未知の蛋白がPit1結合DNA配列に特異的に結合することが示された。現在、この蛋白をクローニングすることを目的に、P1をプローベとして、サウスウェスタン法で,Cos細胞cDNA Libraryをスクリーニング中である。