アルカリフォスファターゼを介した好中球シグナル伝達経路の研究

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好中球膜表面に発現する酵素であるアルカルフォスファターゼ(好中球アルカリフォスファターゼ;NAP)の新しい機能として細胞内にシグナルを伝達する可能性があるかどうかを検討した。用いた方法はNAPを抗体でクロスリンクすることにより細胞内蛋白のチロシン燐酸化が起こるかどうかを検討することにより、細胞内にシグナルが伝わっているかどうかを見る方法である。正常人末梢血あるいは骨髄由来の好中球または真性多血症患者の末梢血由来好中球をフィコール法により精製し標的細胞とした。精製好中球を1%BSA/RPMI中に浮遊し、抗体を加えてから、30秒、1分、2分、5分、10分、後に直ちに細胞を回収し、液体窒素により凍結した。凍結細胞はリシスバッファーにより溶解後遠心し、その上澄みをSDS-PAGEにより展開した。分離された蛋白はPVDFメンブレンに移した後、PY20あるいは4G10抗体と反応させ、ECL法により解析した。その結果、抗体添加早期にチロシン燐酸化される分子量約56kdの細胞内蛋白が見つかった。この蛋白は免疫複合体キナーゼ反応、再免疫沈降法等によってもsrc,fyn,lyn,hck,fgr,blk等と同一のものとは断定できなかった。また一部のコントロール抗体でも同様のシグナルが細胞内に認められ、抗体の更なる処理{F(ab′)_2化等}が必要と思われた。