DNAを連結したRNaseHによるRNAの配列特異的切断

DNA 连接的 RNaseH 对 RNA 进行序列特异性切割

• 批准号: 10145233
• 负责人: 金谷 茂則
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10145233/
• 关键词: RNaseH; ハイブリッド酵素; DNA; RNA; 配列特異的切断; 部位特異的変異法; ジスルフィド結合; 耐熱性

本研究の目的は、DNAを連結した好熱菌RNaseHlを用いてRNAを配列特異的に切断することである。しかし、DNAを好熱菌RNaseHlに連結するためには分子表面にCysを1残基だけ持つ好熱菌RNaseHl変異体を構築する必要がある。ところで好熱菌RNaseHlには13、41、63、149位に4残基のCysが存在する。そこで、まずこれらのCysの酵素活性や安定性に対する役割を明らかにする目的で、これらを全てAlaに置換した。その結果、Cysフリー変異体C13A/C41A/C63A/C149Aの熱安定性も酵素活性も野生型酵素のものより大きく低下することを見いだした。これら4つの変異のうちどれか一つだけをもつ変異体4種類を構築し、その熱安定性や酵素活性を調べることにより、熱安定性の低下はC41AかC149Aの変異によって引き起こされ、酵素活性の低下はC13Aの変異によって引き起こされることを明らかにした。さらに、ペプチドマッピングを行うことにより、酵素の精製中に41位と149位のCys間に自発的にジスルフィド結合が形成されること、菌体内ではこれらのCysは還元状態にあることなどを明らかにした。変異体C13A/C63Aの熱安定性は野生型酵素のものとほぼ同じであったので、41位と149位のCysは改変しないことにした。また、13位のCysについてはAla変異体よりSer変異体の方が高い活性を示したので、Serに置換することにした。DNA連結部位として利用するCysは、計画通り135位のArgをCysに置換することにより導入した。この結果構築された変異体C13S/C63A/R135Cの酵素活性は野生型酵素の10%に低下したが、耐熱性は野生型酵素とほぼ同じであったので、今後はこの変異体を用いてハイブリッド酵素を構築する予定である。

The purpose of this study is to use the DNA-linked Thermophilic bacterium RNaseHl to cleave the specific DNA sequence using RNA.しかし、DNAをAerothermobacter RNaseHl is connected to the molecular surface and Cysを1 residue is maintained and the Thermophilic bacteria RNaseHl isoform is constructed and is necessary to be constructed. The Thermophilus RNaseHl contains Cys 4 residues at positions 13, 41, 63, and 149.そこで、まずこれらのCysのEnzyme activity やStability に対するServant cut を明らかにするpurpose で、これらを全てAlaにReplacement した.そのRESULTS, Cysフリー変variant C13A/C41A/C63A/C149A, のthermal stability, enzyme activity, wild-type enzyme, large きく, low することを见いだした.これら4つの変different のうちどれか一つだけをもつ変different 4 typesをConstructionし、そのThermal stability やEnzyme activity を Adjustment べることにより、Thermal stability is lowはC41A and C149A are different and the enzyme activity is Low はC13A の変different によって影起こされることを明らかにした.さらに、ペプチドマッピングを行うことにより、Enzyme のRefined 41st and 149th Cys between に自発的にジThe combination of スルフィドが forms されること, and the ではこれらのCysは in the bacteria returns to its original state にあることなどを明らかにした. The thermal stability of the allogeneic C13A/C63A wild-type enzyme is the same as that of the wild-type enzyme, and the 41-bit and 149-bit Cys has been modified to be the same as the wild-type enzyme.また, 13-bit のCysについてはAla変variant よりSer変variant のsquareが高いactiveをshow したので,Serに substitution することにした. The DNA linking site is made of Cys, and the 135-bit Arg Cys replacement is planned to be introduced. The result of the construction is that the enzyme activity of the allogeneic C13S/C63A/R135C is 10% of the wild-type enzyme, and the resistance is reduced. Thermal wild-type enzyme とほぼ Same as じであったので, and the future はこの変variant を is constructed with いてハイブリッド enzyme を predetermined する.

项目成果

Nobutaka Hirano et al.: "Stabilization of RNase HI from Thermus thermophilus HB8 by the spontaneous formation of an intramolecular disulfide bond" Biochemistry. 37. 12640-12648 (1998)

Nobutaka Hirano 等人：“通过自发形成分子内二硫键来稳定嗜热栖热菌 HB8 的 RNase HI”生物化学。