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耐熱性ハイブリッドRNaseHによるRNAの配列特異的分解

热稳定性杂化 RNaseH 对 RNA 进行序列特异性降解

基本信息

批准号：
12019243
负责人：
金谷茂則
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12019243/
关键词：
ハイブリッド酵素配列特異的切断 RNA DNA MS2 RNA RNase H 好熱菌大腸菌

项目摘要

本研究の目的は、安定な高次構造を形成するRNAでも配列特異的に効率よく分解するハイブリッド酵素を開発することである。これまでの研究の結果、15-merDNAを連結した好熱菌RNaseHIは、15-merDNAを連結した大腸菌RNaseHIが活性を示さない高温でも15-merRNAを効率よく配列特異的に分解することが明らかにされている。そこで今年度は、DNAを連結した好熱菌BNaseHIを用いて安定な高次構造を形成するMS2RNAを配列特異的に分解することを試みた。バクテリオファージ由来MS2RNAは3569塩基から成り、複雑なstem-loop構造を有する安定な高次構造を形成する。MS2RNA塩基配列の2781番目から2796番目までの塩基配列に相補的な16-merDNAを好熱菌RNaseHIに連結したハイブリッド酵素d16-TRNHと大腸菌RNaseHIに連結したハイブリッド酵素d16-ERNHを構築し、様々な温度でMS2RNAとインキュベートした。もしMS2RNAが目的の位置でのみ切断されるならば、800塩基から成るRNA断片と2800塩基から成るRNA断片が生じるはずである。これらの断片を8M尿素を含む3.5%ポリアクリルアミドゲルを用いるゲル電気泳動で解析したところ、MS2RNAとD16-TRNHを65℃以上の高温でインキュベートした時だけ800塩基から成るRNA断片が生成することがわかった。このRNA断片は、MS2RNAだけを電気泳動した時も、MS2RNAとD16-ERNHをいかなる温度でインキュベートした時も検出されなかった。以上の結果は、好熱菌RNaseHIを用いて構築したハイブリッド酵素は安定な高次構造を形成するRNAでも高温で配列特異的に分解することを示唆する。今後は、逆転写酵素によるプライマー伸長法などにより切断点の同定を行う予定である。

The purpose of this study is to stabilize the formation of high-order structures, RNA, and sequence-specific enzymes. The results of this study indicate that 15-merRNA is linked to the activity of E. coli RNase HI and 15-merDNA is linked to the activity of E. coli RNase HI. This year's DNA link is good for BNaseHI. It is used to form high-order structures. It is used to decompose MS2 RNA. The origin of this phenomenon is the formation of a complex stem-loop structure at the base of MS2 RNA 3569, and the formation of a stable high-order structure. MS2 RNA base alignment 2781 - 2796- MS2 RNA is cut off at the target site, 800 bp, and 2800 bp. 8M Urea contains 3.5% of the total RNA and D16-TRNH. The total RNA fragments are generated at temperatures above 65℃. The RNA fragments, MS2 RNA and D16-ERNH are electrically activated. These results demonstrate the ability of the enzyme to construct stable high-order structures at elevated temperatures. In the future, reverse transcription enzymes will be used to cut off the same line.