超好熱古細菌獲得免疫系の解明と応用に関する研究

原核生物の免疫システムは特殊な反復配列CRISPRと多数の関連遺伝子から成り、CRISPRの間に挿入された配列と同じ配列を持つDNAファージやウイルスによる感染を阻害する。本研究においては、原核生物の獲得免疫系として報告されているCRISPR-Casシステムの分子メカニズムを明らかにするとともに、このシステムが産業上有用な生物の開発及び疾病の予防や治療に、実際に応用できるかどうか検証することを最終目的とする。具体的には、超好熱古細菌を用いて、新規Cas蛋白質の分離・同定、結晶構造解析を行う。また、この新規Cas蛋白質と相互作用する基質や蛋白質を同定することにより本蛋白質の機能を明らかにする。本年度は、T. kodakaraensis KOD1由来TKO460遺伝子がコードする機能未知蛋白質TKO460(TK-Cas3)とS.tokodaii7由来STOO29遺伝子がコードする機能未知蛋白質STOO29(ST-Csa2)の機能及び基質認識機構を立体構造の観点から理解することを目的として、結晶化及びX-線結晶構造解析を行った。その結果、TK-Cas3蛋白質とST-Csa2蛋白質の結晶化に成功した。しかし、これらの結晶を用いて解析しても、これらの蛋白質とアミノ酸配列の相同性を示す蛋白質の構造が報告されていないため、分子置換法により結晶構造を決定することはできない。そこで、それらの蛋白質のセレノメチオニン置換体を大量発現し、精製した。セレノメチオニン置換体を用い最適化した条件下で結晶化を行い、結晶のX線回折データの収集を行った。これらのデータからMAD法により位相を決定し、これに基づいて分子モデルを作製している。これらの結果から、本研究では新規Cas蛋白質の分離・精製、結晶化、さらにはこれらの新規Cas蛋白質の構造を明らかにするためのX-rayデータの収集に成功した。このことにより新規Cas蛋白質の構造解析が可能になり、立体構造に基づく新規Cas蛋白質の機能解析と他のCAS蛋白質との相互作用解析が可能になると期待される。

原核生物の免疫システムは特殊な反復配列CRISPRと多数の関連遺伝子から成り、CRISPRの間に挿入された配列と同じ配列を持つDNAファージやウイルスによる感染を阻害する。本研究においては、原核生物の獲得免疫系として報告されているCRISPR-Casシステムの分子メカニズムを明らかにするとともに、このシステムが産業上有用な生物の開発及び疾病の予防や治療に、実際に応用できるかどうか検証することを最終目的とする。具体的には、超好熱古細菌を用いて、新規Cas蛋白質の分離・同定、結晶構造解析を行う。また、この新規Cas蛋白質と相互作用する基質や蛋白質を同定することにより本蛋白質の機能を明らかにする。本年度は、T. kodakaraensis KOD1由来TKO460遺伝子がコードする機能未知蛋白質TKO460(TK-Cas3)とS.tokodaii7由来STOO29遺伝子がコードする機能未知蛋白質STOO29(ST-Csa2)の機能及び基質認識機構を立体構造の観点から理解することを目的として、結晶化及びX-線結晶構造解析を行った。その結果、TK-Cas3蛋白質とST-Csa2蛋白質の結晶化に成功した。しかし、これらの結晶を用いて解析しても、これらの蛋白質とアミノ酸配列の相同性を示す蛋白質の構造が報告されていないため、分子置換法により結晶構造を決定することはできない。そこで、それらの蛋白質のセレノメチオニン置換体を大量発現し、精製した。セレノメチオニン置換体を用い最適化した条件下で結晶化を行い、結晶のX線回折データの収集を行った。これらのデータからMAD法により位相を決定し、これに基づいて分子モデルを作製している。これらの結果から、本研究では新規Cas蛋白質の分離・精製、結晶化、さらにはこれらの新規Cas蛋白質の構造を明らかにするためのX-rayデータの収集に成功した。このことにより新規Cas蛋白質の構造解析が可能になり、立体構造に基づく新規Cas蛋白質の機能解析と他のCAS蛋白質との相互作用解析が可能になると期待される。