GTP駆動性小胞輸送タンパク質(Sar1p)のX線結晶解析

GTP 驱动的囊泡转运蛋白 (Sar1p) 的 X 射线晶体分析

• 批准号: 10179213
• 负责人: 佐藤 孝雄
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10179213/
• 关键词: GTP結合タンパク質; 小胞輸送; 実験計画法; 回帰・分散分析; 動的光散乱法; 応答曲面解析; ニューラルネットワーク; 結晶化前実験法

本研究の標的タンパク質は、分子量21kDaのGTP結合タンパク質(以下Sarlpと称する)である。Sarlpは、真核細胞の特有の分泌経路(小胞体→ゴルジ体→分泌小胞→細胞膜)を有し、この小胞輸送という過程に関与し、主に小胞体に局在している。生合成されたタンパク質を小胞体からゴルジ体へ輸送過程で、輸送小胞の形成に必須である。また、Sarlpが輸送小胞からハズレて小胞体に戻る過程でSarlpによるGTP加水分解は重要である。本申請の到達目標は、SarlpのX線解析であるが、結晶化条件を予知する方法の開発でもある。この結晶化検索に、本質的な要因を選択するために、まず第一に、ネイティブ等電点を活用する。第二に、結晶化条件を迅速に見出すために統計学的な手法による最適化法の構築である。標的Sarlpタンパク質およびGTPアナログ結合複合体の結晶化の可能性の高い水準領域を、系統的に検索する。即ち、検索範囲を点から二次元に拡張して結晶化実験の高能率化を計る。その手順は、ステップ(1)「不完備要因配置」実験計画法の立案。ステップ(2)そのプロトコールに従って、結晶化条件を検索する実験を実施。ステップ(3)その実験結果を評価するために、動的光散乱法から得られる粒径分布等の流体力学的パラメータやX線小角散乱法よる慣性半径の利用。ステップ(4)得られたデータで、回帰・分散分析、また応答曲面解析、さらに統計的なニューラルネットワークによる最適モデルの獲得。現在、生化学的な実験施設を保有していない状況であるので、本年度は、等電点電気泳動システムといった生化学実験系の整備、ステップ(3)の動的光散乱計といった結晶化検索の前実験測定系の整備、ステップ(4)の統計学的な手法(ソフトウェアTrial runとNeural Connection)の導入により、結晶化前実験方法の確立を追及している。

The target protein of this study is a GTP binding protein with a molecular weight of 21kDa. Sarlp has a unique secretory pathway in eukaryotes (vesicle → vesicle → secretory vesicle → cell membrane), which is related to the process of vesicle transport and the main vesicle. The process of biosynthesis and transport of small cells must be carried out. Moreover, the hydrolysis of GTP in Sarlp is important in the process of transporting small cells and transporting small cells. This application aims to achieve the goal of X-ray analysis of Sarlp and the development of crystallization conditions. The main factors of crystallization are: Second, the crystallization conditions are quickly identified and statistical techniques are used to construct optimization methods. The possibility of crystallization of target Sarlp complex and GTP complex is discussed in detail. That is to say, the crystallization and high energy efficiency of crystallization are calculated from the point of view of the two-dimensional expansion. (1)"incomplete factor allocation" to implement the planning law. (2) The crystallization conditions are determined and implemented. Evaluation of the results obtained by the dynamic light scattering method, particle size distribution, etc., and utilization of inertia radius by the X-ray small angle scattering method. The results obtained from (4) are: data analysis, regression analysis, dispersion analysis, surface analysis, statistical analysis, and optimization. In the present year, the preparation of the biochemical system, the preparation of the kinetic optical scattering meter of the isoelectric point, the preparation of the crystallization model, the introduction of the statistical method of the crystallization model, and the establishment of the pre-crystallization method have been investigated.