GTP駆動性小胞輸送タンパク質(Sar1p)のX線結晶解析

本研究の標的タンパク質は、分子量21kDaのGTP結合タンパク質(以下Sarlpと称する)である。Sarlpは、真核細胞の特有の分泌経路(小胞体→ゴルジ体→分泌小胞→細胞膜)を有し、この小胞輸送という過程に関与し、主に小胞体に局在している。生合成されたタンパク質を小胞体からゴルジ体へ輸送過程で、輸送小胞の形成に必須である。また、Sarlpが輸送小胞からハズレて小胞体に戻る過程でSarlpによるGTP加水分解は重要である。本申請の到達目標は、SarlpのX線解析であるが、結晶化条件を予知する方法の開発でもある。この結晶化検索に、本質的な要因を選択するために、まず第一に、ネイティブ等電点を活用する。第二に、結晶化条件を迅速に見出すために統計学的な手法による最適化法の構築である。標的Sarlpタンパク質およびGTPアナログ結合複合体の結晶化の可能性の高い水準領域を、系統的に検索する。即ち、検索範囲を点から二次元に拡張して結晶化実験の高能率化を計る。その手順は、ステップ(1)「不完備要因配置」実験計画法の立案。ステップ(2)そのプロトコールに従って、結晶化条件を検索する実験を実施。ステップ(3)その実験結果を評価するために、動的光散乱法から得られる粒径分布等の流体力学的パラメータやX線小角散乱法よる慣性半径の利用。ステップ(4)得られたデータで、回帰・分散分析、また応答曲面解析、さらに統計的なニューラルネットワークによる最適モデルの獲得。現在、生化学的な実験施設を保有していない状況であるので、本年度は、等電点電気泳動システムといった生化学実験系の整備、ステップ(3)の動的光散乱計といった結晶化検索の前実験測定系の整備、ステップ(4)の統計学的な手法(ソフトウェアTrial runとNeural Connection)の導入により、結晶化前実験方法の確立を追及している。

本研究の標的タンパク質は、分子量21kDaのGTP結合タンパク質(以下Sarlpと称する)である。Sarlpは、真核細胞の特有の分泌経路(小胞体→ゴルジ体→分泌小胞→細胞膜)を有し、この小胞輸送という過程に関与し、主に小胞体に局在している。生合成されたタンパク質を小胞体からゴルジ体へ輸送過程で、輸送小胞の形成に必須である。また、Sarlpが輸送小胞からハズレて小胞体に戻る過程でSarlpによるGTP加水分解は重要である。本申請の到達目標は、SarlpのX線解析であるが、結晶化条件を予知する方法の開発でもある。この結晶化検索に、本質的な要因を選択するために、まず第一に、ネイティブ等電点を活用する。第二に、結晶化条件を迅速に見出すために統計学的な手法による最適化法の構築である。標的Sarlpタンパク質およびGTPアナログ結合複合体の結晶化の可能性の高い水準領域を、系統的に検索する。即ち、検索範囲を点から二次元に拡張して結晶化実験の高能率化を計る。その手順は、ステップ(1)「不完備要因配置」実験計画法の立案。ステップ(2)そのプロトコールに従って、結晶化条件を検索する実験を実施。ステップ(3)その実験結果を評価するために、動的光散乱法から得られる粒径分布等の流体力学的パラメータやX線小角散乱法よる慣性半径の利用。ステップ(4)得られたデータで、回帰・分散分析、また応答曲面解析、さらに統計的なニューラルネットワークによる最適モデルの獲得。現在、生化学的な実験施設を保有していない状況であるので、本年度は、等電点電気泳動システムといった生化学実験系の整備、ステップ(3)の動的光散乱計といった結晶化検索の前実験測定系の整備、ステップ(4)の統計学的な手法(ソフトウェアTrial runとNeural Connection)の導入により、結晶化前実験方法の確立を追及している。