環境汚染物質の遺伝子モニタリング法の開発

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複数の環境汚染物質に対し生体が示す共通の生体内標的分子を明らかにし、より広範な高危険群(遺伝的感受性者)の掘り起こしと共に一定の毒性を示す環境汚染物質の検索を迅速に行うために、複数の重金属に耐性(生体の防御機構の一面)を示す人遺伝子と共通する遺伝子を持つ酵母株をより安定かつ効率的に検索・選別する方法を検討した。使用酵母は対照酵母:W303B株(MATα his3 can1-100 age1 leu2 try1 ura3)にベクター(プラスミドYEp13;ロイシン合成遺伝子を含む)のみを導入した酵母。ロイシンを含まないSDM培地中で成育可能、実験酵母(形質転換酵母):酵母DNAライブラリーをベクターYep13を用いて対照酵母に導入した酵母。(1)平成10年度には、重金属モデルとしてカドミウムCdを取り上げ、その感受性を確認し、耐性選択濃度(30μM)を決定し。更に、実験酵母を作成し、Cd及びロイシン濃度をを変えた培地とレプリカ法の組合せにより、自然耐性酵母と導入遺伝子によるCd耐性獲得験酵母を選別した。(2)平成11年には、1)対照酵母のCd以外の金属に対する感受性の確認:通常生育できない濃度は水銀(HgCl_2)130μM、スズ(SnCl_2・2H_2O)20mM、セレン(Na_2SeO_3)2.5mM、銅(CuCl_2)13mM、亜鉛(ZnCl_2)10mM、砒素(Na_2AsO_2)0.5mM。2)高度Cd耐性酵母株の検索し200μMCdCl_2に対する耐性株を得、3)得られた200μMCdCl_2耐性株の他の金属への生育不能濃度は、水銀(HgCl_2)500μM、スズ(SnCl_2・2H_2O)20mM、セレン(Na_2SeO_3)2.5mM、銅(CuCl_2)13mM、亜鉛(ZnCl_2)9mM、砒素(Na_2AsO_2)2mMであった。以上から、対照酵母から得たCd自然耐性株には、水銀及び砒素に対する耐性も同時に獲得し、亜鉛にはむしろ感受性を高め、セレン、銅については耐性を示さない機構がある事が推察された。(3)平成12年には、1)対照酵母と新たに作成した形質転換酵母の金属感受性を確認:形質転換酵母は対照酵母より砒素(Na_2AsO_2)、亜鉛(ZnCl_2)に感受性が高く、カドミウム(CdCl_2)耐性(生育不能濃度50μM)の傾向があった。2)選択培地による実験(形質転換)酵母プラスミド遊離実験の時間短縮:耐性株のプラスミド遊離操作はこれまで寒天培地で4〜6日かけて確認していたが、試験管による0℃と30℃培養試料の比較法に変える事で8〜16時間に短縮した。3)液体培地で2)のように増殖判定した結果、レプリカ法に用いるマスタープレート作成も短時間で行えるようになり、耐性選択プレートから酵母を釣ってマスタープレートを作成するまで従来最低でも10日かかっていたのが、2〜3日で可能となった。3)レプリカ法の検討:マスタープレートにまく酵母数を100から5000こまで検討した結果プレーと当り100個が判別のためには適当であった。コロニーを移す素材として従来使われているベルベットより安価で簡便なガーゼの使用を検討し、BEMCOT4枚重ね又はハクジュウ、ディスポガーゼ2号2枚重ねで一瞬(コロニー直径1mm以上)から5秒(コロニー直径1mm未満)プレートをそっと置くだけで良い結果が得られる事が分かった。効率化した方法により耐性株が得やすくなり遺伝子の解析、機能遺伝子の推定、蛋白同定に資すると思われる。