LPSのマウスB細胞内結合分子の解析

小鼠 B 细胞中 LPS 结合分子的分析

• 批准号: 10877290
• 负责人: 浜田 茂幸
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10877290/
• 关键词: LPS; 細胞内結合分子; マウスB細胞; リボソームタンパク; cDNAクローニング; リコンビナントタンパク

LPSによる刺激は生体細胞表面上のCD14を介して細胞内にシグナル伝達されるが,一方で,スカベンジャーレセプターを介してLPS分子のままで,あるいはLPSがCD14と結合した状態で生体細胞内へ取り込まれる可能性も示唆されている.しかし,細胞内でのLPS分子の挙動については明らかとはなっていない.本研究では,LPSの細胞内結合分子を明らかにすることを目的に,LPS反応性のマウスB細胞由来株化細胞(CH12.LX細胞)を用いてLPSが特異的に結合する生体細胞内分子を分画し,得られた試料より分子生物学的手法を用いて細胞内の特異的なLPS結合部位について検討した.まず,CH12.LX細胞をCHAPSを用いて溶解後,カラム分画により,Escherichia coli由来のLPSに特異的結合を示す細胞内タンパクを精製した.LPSとの結合能はenzyme-linked biotin-avidin assayにより行った.調製したタンパクのN末端シーケンスを行い,部分アミノ酸配列を決定した.その結果,ラットのリボゾームタンパクL5と高い相同性を示すことが推定された.そこで,L5タンパクの推定塩基配列から設計したプライマーを用いて,マウスcDNAライブラリーよりPCR法によりマウスリボソームタンパク(L5m)のcDNAクローニングを行った.cDNAのシークエンスの結果,マウスのL5mの塩基配列はラットのそれと高い相同性を示した.得られたcDNAを大腸菌の高発現ベクターであるpTrc99を用いて発現させたところ,SDS-PAGE上で約36kDaのリコンビナントタンパクのバンドが認められた.このリコンビナントタンパクにおいてもLPSとの特異的な結合が認められた.以上の結果より,LPSが特異的に結合するマウス細胞内分子の一つはリボソームタンパクL5mであることが明らかとなった.

LPS に よ る stimulus は cells on the surface of raw の CD14 を interface し て in cells に シ グ ナ ル 伝 da さ れ る が, one party で, ス カ ベ ン ジ ャ ー レ セ プ タ ー を interface し て LPS molecules の ま ま で, あ る い は LPS が CD14 と combining し た state で へ within living cells take り 込 ま れ も る possibility in stopping さ れ て い る. し か し, cells The internal で <s:1> LPS molecule <e:1> 挙 is activated by に で て て に, ら と, なって, な, な and な. This study で は, LPS の cells combined with molecular を Ming ら か に す る こ と に を purpose, LPS anti 応 sex の マ ウ ス origin plants the B cells (CH12. LX cells) を い て LPS が specific に combining す る molecular を points draw し within living cells, to ら れ た sample よ り molecular biology technique を with い の て cell specific な LPS Combining site に つ い て beg し 検 た. ま ず, CH12. LX cells を CHAPS を with い て dissolves, カ ラ ム points draw に よ り, Escherichia coli origin の LPS に specific combination を す cells within タ ン パ ク を refined し た. LPS と の binding energy は enzyme - linked biotin-avidin assayによ った lines った. Modulation し た タ ン パ ク の N terminal シ ー ケ ン ス を い, part ア ミ ノ acid with column を decided し た. そ の results, ラ ッ ト の リ ボ ゾ ー ム タ ン パ ク L5 と high い identity を shown す こ と が presumption さ れ た. そ こ で, L5 タ ン パ ク の presumption of salt base with column か ら design し た プ ラ イ マ ー を with い て, マ ウ ス cDNA ラ イ ブ ラ リ ー よ り PCR method に よ り マ ウ ス リ ボ ソ ー ム タ ン パ ク (L5m) の cDNA ク ロ ー ニ ン グ を line っ た. CDNA の シ ー ク エ ン ス の results, マ ウ ス の L5m の salt base with column は ラ ッ ト の そ れ と high い identity を shown し た. Have ら れ た cDNA を coliform の high 発 now ベ ク タ ー で あ る pTrc99 を with い て 発 now さ せ た と こ ろ, sds-page on で about 36 kda の リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク の バ ン ド が recognize め ら れ た. こ の リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク に お い て も LPS と の specific な combining が recognize め ら れ た. Results above の よ り, LPS が specific に combining す る マ ウ ス intracellular molecules の a つ は リ ボ ソ ー ム タ ン パ ク L5m で あ る こ と が Ming ら か と な っ た.

项目成果

Takemura,A.,et al.: "A novel component different from endotoxin extracted from Prevotella intermedia ATCC25611 activates lymphoid cells from C3H/HeJ mice and gingival fibroblasts from humans" Jouranl of Periodontal Research. 33. 400-407 (1998)

Takemura,A.,et al.：“一种不同于从中间普雷沃氏菌 ATCC25611 中提取的内毒素的新成分，可激活 C3H/HeJ 小鼠的淋巴细胞和人类的牙龈成纤维细胞”《牙周研究杂志》。

Iki,K.,et al.: "Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide modulates the responsiveness of human periodontal ligament fibroblasts to platelet-derived growth factor" Infection and Immunity. 65・11. 4531-4538 (1997)

Iki, K., 等人：“牙龈卟啉单胞菌脂多糖调节人牙周膜成纤维细胞对血小板衍生生长因子的反应”，感染与免疫 65・11 (1997)。