ヌクレオソーム形成過程のリアルタイム1分子観察

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1) アフリカツメガエル卵母細胞抽出液から超遠心によりヌクレオソーム形成に必要な、ヒストン等のタンパク質因子を含んでいるフラクションを調製した。DNAおよびATP産生系を加えた反応生成物をヌクレオソームで消化したところ、l50bpから180bpの長さのヌクレオタイドが生成した。これは、クロマチンをヌクレオソームで消化したときの生成フラグメントと一致し、アフリカツメガエル卵母細胞抽出液フラクションがヒストンにDNAを巻き付けたヌクレオソームを形成していることを示唆する。この系を用いて、DNA1分子上でのヌクレオソーム形成過程を観察ることにした。2) 両端を微小ポリスチレンビーズで固定したDNA1分子を2スポットの光ピンセットで保持しながら、上記の卵母細胞抽出液フラクションを導入するために、フローセルの作成を行った。フローセルを用いて保持したDNAに蛍光色素YOYO-1を作用させ、色素が結合することによりDNAの分子長が1.5倍長くなることを観察した。3) YOYO-1存在下でDNAに張力を加えたときのDNA分子長を測定し、張力-分子長の関係をプロットしたところ、張力を増加させていったときと、減少させていったときのカーブに違いがあった。この違いを詳細に検討した結果、DNAの伸びは張力のかける速さに依存する、すなわち速く引っ張ると、伸びが少ないことが分かった。これはYOYO-1がDNAに結合する様式が複数あり、その間の転移に時間を要することを示唆している。