一分子観察によるF_1モーターの回転と酵素反応ステップの関係の解明

通过单分子观察阐明F_1电机旋转与酶反应步骤之间的关系

• 批准号: 11156210
• 负责人: 宗行 英朗
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11156210/
• 关键词: 一分子観察; ATP合成酵素; F_1-ATPase

F_1モーターの回転機構を解明するために以下の研究を行った.まず,結晶構造から,ヌクレオチドの有無によって大きく二面角が変化するアミノ酸残基を探し出した.それによると,ミオシンATPaseでヒンジ領域といわれている部分に対応する残基番号179-181のHis,Gly,Gly残基が大きな二面角の変化を起こすことがわかり,それをAlaに変異させた.この変異によりβサブユニットのヌクレオチド結合型のコンフォメーションが安定化し,何らかの影響が回転に現れると期待した。しかし結果はF_1-ATPaseに特徴的なADP・Mgによる特異的阻害状態を安定化する効果を示し,回転の頻度は低くしたが,回転に伴うトルクなどには目立った影響を与えなかった。安定化の度合いを阻害状態の安定性から見積もったところ,エネルギー的にはごく小さな変化が速度的には大きく表れているとの結論を得た.次に触媒部位付近にTrpを導入した変異体でヌクレオチド結合とATP加水分解活性の関係を調べた.野生型の酵素にこのTrp変異を導入した変異体では,ATP結合と加水分解活性の間に必ずしも明瞭な関係が見られなかった.これは非触媒部位へのATP結合の影響によるものと考えて,非触媒部位を破壊する変異を更に加えて検討した.その結果,最大活性は3カ所の触媒部位に同時にATPが結合したときに得られることがより明澄に確認できた.一方,非触媒部位を破壊した変異体で,回転を観察した.この場合,ADPによる特異的阻害が非常に強く,観察が困難であったのでさらにβT165S変異を導入した.その結果,ADPによる特異的阻害は回転が完全に停止した状態であること,それ以外にも小刻みな回転・停止状態があることがわかった.

F_1 and the return mechanism are explained in detail. The crystal structure is different, and the acid residue is detected. In the middle part of the ATPase domain, residues 179-181 and His,Gly,Gly residues were converted into large dihedral angles. The effect of these changes on the stability of the system is expected. As a result, F_1-ATPase characteristics of ADP·Mg and specific resistance state to stabilize the effect, the frequency of return to the low, return to the opposite side of the eye impact The stability of the stability of the resistance state is different from that of the stability of the resistance state. The relationship between the catalytic site and ATP hydrolysis activity was modulated by the introduction of Trp. The relationship between ATP binding and hydrolytic activity is clearly established. This paper discusses the influence of ATP binding on non-catalytic sites, and the influence of ATP binding on non-catalytic sites. As a result, the maximum activity was determined by ATP binding at the catalytic site of 3 ° C. One side, the non-catalytic part of the broken body, back to the detection. In this case,ADP has a very strong resistance, and it is difficult to detect β T165S. As a result,ADP is a specific barrier to return to a completely stopped state.

项目成果

Eiro Muneyuki, Hiroyuki Noji, Toyoki Amano, Tomoko Masaike and Masasuke Yoshida: "F_0F_1-ATP synthase ; general structural features of "ATP-engine" and a problem of free energy transduction"Biochem. Biophys. Acta in press. (2000)

Eiro Muneyuki、Hiroyuki Noji、Toyoki Amano、Tomoko Masaike 和 Masasuke Yoshida：“F_0F_1-ATP 合成酶；“ATP 引擎”的一般结构特征和自由能转导问题”Biochem。

Dirk Bold, Eiro Muneyuki, Toyoki Amano, Jochen Kruip. Toru: "The noncatalytic site-deficient α_3β_3γ subcomplex and F_0F_1-ATP synthase ca continuously catalyze ATP hydrolysis when Pi is present"Eur. J. Biochem.. 262. 563-568 (1999)

Dirk Bold、Eiro Muneyuki、Toyoki Amano、Jochen Kruip。“当 Pi 存在时，非催化位点缺陷的 α_3β_3γ 亚复合物和 F_0F_1-ATP 合酶可连续催化 ATP 水解”Eur. 262. 563-568 1999）

Eiro Muneyuki and Takaaki A. Fukami: "Properties of the stochastic energization-relaxation channel model for vectorial ion transport"Biophys. J. in press. 78 (3). (2000)

Eiro Muneyuki 和 Takaaki A. Fukami：“矢量离子传输的随机激励-弛豫通道模型的特性”Biophys。

Tomoko Masaike, Hiroyuki Noji, Eiro Muneyuki, Rhyohei Yasuda, Kazuhiko Kinoshita Jr. and Masasuke Yoshida: "Rotation of F_1-ATPase and the hinge residues of the β subunit"J. Exper. Biol.. 203. 1-8 (2000)

Tomoko Masaike、Hiroyuki Noji、Eiro Muneyuki、Ryohei Yasuda、Kazuhiko Kinoshita Jr. 和 Masasuke Yoshida：“F_1-ATP 酶的旋转和 β 亚基的铰链残基”J. Biol. 203. 1-8 (2000)

Satoshi P. Tsunoda, Eiro Muneyuki, Toyoki Amano, Masasuke Yoshida, and Hiroyuki Noji: "Cross-linking of Two Subunits in the Closed Conformation in F_1-ATPase"J. Biol. Chem.. 274. 5701-5706 (1999)

Satoshi P. Tsunoda、Eiro Muneyuki、Toyoki Amano、Masuke Yoshida 和 Hiroyuki Noji：“F_1-ATP 酶闭合构象中两个亚基的交联”J。