一分子観察によるF.モーターの回転と酵素反応ステップの関係の解明

F. 通过单分子观察阐明电机旋转与酶反应步骤之间的关系

• 批准号: 12030210
• 负责人: 宗行 英朗
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12030210/
• 关键词: 一分子観察; ATP合成酵素; F_1-ATPase; モータータンパク質

F_1モーターの回転機構を解明するために以下の研究を行った.昨年度,結晶構造から,残基番号181のGly残基がヌクレオチドの有無によって大きく二面角を変化させる事を発見し,これをAlaに変異させると,F_1-ATPaseに特徴的なADP・Mgによる阻害状態に陥りにくくなることを発見した.このADP・Mgによる特異的阻害状態は,F_1モーターの回転機構を解析する上で大きな障害となる.そこで,この変異と165番目のThrをSerに置換する変異を同時に導入して,阻害を受けにくい変異体を作成した.更に,ヌクレオチド結合を容易に観察するために触媒部位付近にTrpを導入した.これらの変異を導入したF_1モーターは,狙い通り,きわめてADP・Mgによる阻害を受けにくくなり,1mMのADP共存下でも容易に回転の一分子観察を行うことができた.このことは,従来不可能であったATPの加水分解の自由エネルギーを広い範囲で制御した条件下での回転観察が可能になったことを意味する.この変異体を用いて,一分子が一動作で行う力学的仕事と統計的性質を持つ入力の自由エネルギーの関係を明らかにしてゆく予定である.またストップトフローを用いた予備的な実験で,ATPの結合のキネティクスを追跡できることを確認している.次に生体分子によるエネルギー変換について理解するために,二つの反応が双方向的・可逆的に共役するモデルを考案し,計算機シミュレーションによってその振る舞いを検討した.その結果,簡単な仮定に基づき,入力・出力の反応の起こる回数の比が非整数で可変と言う性質の得られるモデルができた.これが実際の蛋白質によるエネルギー変換機構とどのような関わりを持つかについても今後考察を深めて行きたい.

F_1モ モ タ タ <e:1> <s:1> return to the 転 institution を to explain するために the following <s:1> research を fields った. Last year, the crystal structure か ら, residue mash 181 の Gly residues が ヌ ク レ オ チ ド の presence of に よ っ て big き く dihedral を variations change さ せ る matter を 発 し, こ れ を Ala に - different さ せ る と, F_1 - ATPase に 徴 な of ADP, Mg に よ る resistance against state に 陥 り に く く な る こ と を 発 see し た. こ の, ADP Mg に よ る specific resistance against state は, F_1 モ ー タ ー の back planning agencies を parsing す る で large き な handicap of と な る. そ こ で, こ の - different と 165's mesh の Thr を Ser に replacement す る - different を also に import し て, resistance against を by け に く い - variant を made し た. More に ヌ ク レ オ チ ド combining を easy に 観 examine す る た め に catalyst sites paying nearly に Trp を import し た. こ れ ら の - different を import し た F_1 モ ー タ ー は, previously い り, き わ め て ADP · Mg に よ る resistance against を by け に く く な り, 1 mm の ADP coexist under で も easy に back planning の line a molecular 観 examine を う こ と が で き た. こ の こ と は 従 to cannot で あ っ た の ATP hydrolysis の free エ ネ ル ギ ー を hiroo い van 囲 で suppression し た conditions で の back planning 観 examine が may に な っ た こ と を mean す る. こ の - variant を with い て, a molecular が action で doeth う mechanics of shi と statistical properties of を hold つ の into force free エ ネ ル ギ ー の masato を and Ming ら か に し て ゆ く designated で あ る. ま た ス ト ッ プ ト フ ロ ー を with い た reserve of な be 験 で, ATP の combining の キ ネ テ ィ ク ス を tracing で き る こ と を confirm し て い る. Times に raw body molecular に よ る エ ネ ル ギ ー variations in に つ い て understand す る た め に, two つ の anti 応 が to both sides, reversible に total service す る モ デ ル し を test case, computer シ ミ ュ レ ー シ ョ ン に よ っ て そ の vibration る dance い を beg し 検 た. そ の results, Jane 単 な 仮 set に base づ き, into force, output の anti 応 の up こ る back several の than が non-integer で variations と talk う nature の ら れ る モ デ ル が で き た. こ れ が be interstate の protein に よ る エ ネ ル ギ ー variations in institutional と ど の よ う な masato わ り を hold つ か に つ い て も future investigation を deep め て line き た い.

项目成果

久堀徹,宗行英朗,野地博行,吉田賢右: "シリーズ・ニューバイオフィジックスII-3 ポンプとトランスポーター(平田肇,茂木立 志編)第一章 ATP合成酵素"共立出版. 22/240 (2000)

Toru Kuhori、Hideaki Muneyuki、Hiroyuki Noji、Kensuke Yoshida：“系列新生物物理学 II-3 泵和转运器（由 Hajime Hirata 和 Tatsushi Mogi 编辑）第 1 章 ATP 合成酶”Kyoritsu Shuppan。

Masaike,T.,Noji,H.,Muneyuki,E.,Yassuda,R.,Kinosita K.Jr.,Yoshida M.: "Rotation of F_1-ATPase and the hinge residues of the β subunit"J.Exp.Biol.. 203. 1-8 (2000)

Masaike, T.、Noji, H.、Muneyuki, E.、Yassuda, R.、Kinosita K.Jr.、Yoshida M.：“F_1-ATPase 的旋转和 β 亚基的铰链残基”J.Exp.Biol .. 203. 1-8 (2000)

Eiro Muneyuki and Takaaki A. Fukami: "Properties of the stochastic energization-relaxation channel model for vectorial ion transport"Biophys. J.. 78. 1166-1175 (2000)

Eiro Muneyuki 和 Takaaki A. Fukami：“矢量离子传输的随机激励-弛豫通道模型的特性”Biophys。

Muneyuki,E.,Noji,H.,Amano,T.,Masaike T.,Yoshida,M.: "FoF_1-ATP synthase ; general structural features of "ATP-engine" and a problem on free energy transduction"Biochim.Biophys.Acta. 1458. 467-481 (2000)

Muneyuki,E.,Noji,H.,Amano,T.,Masaike T.,Yoshida,M.：“FoF_1-ATP 合成酶；“ATP 引擎”的一般结构特征和自由能转导问题”Biochim.Biophys