細胞増殖制御の新しいシグナル伝達経路に関わる蛋白質の立体構造の解明

阐明参与控制细胞增殖的新信号转导途径的蛋白质的三维结构

• 批准号: 11160203
• 负责人: 田中 信夫
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11160203/
• 关键词: シグナル伝達; 立体構造; 細胞増殖

肝臓における組織損傷は肝細胞増殖因子(HGF)がHGF応答細胞(上皮細胞)に存在する受容体に結合し,その情報を伝達することによって細胞分裂を引き起こし修復する。この過程においてHrs(HGF-regulated tyrosine kinase substrate)はHbpとの複合体の形で小胞の出芽、輸送、融合に関与していることが示唆されている。本研究ではHrsの機能を解明するため、その構造決定を目的とし、発現系の検討を行った。domain,Proline rich region,Coiled coil motifやP/Q rich regionをもっている。その発現はGSTタグをN末端に付加した形で、ベクターとしてpGEX-4T-2を用い大腸菌により全構造について試みたが、GST-affinityカラムにより精製した後にも、切断された分子量の小さい蛋白質分子が多く存在し、発現した酵素が分解していることを示した。このため、VHSドメインやFYVEドメインからなる機能的に興味深いN末ドメイン(253残基、HrsN)の発現を行い精製したが、精製標品が時間の経過とともに分解することが観測された。これはGSTタグの分子量とHrsN分子量がほぼ等しくなりその影響であることが懸念されたのでタグをHisタグに交換して発現系を組立て発現させた。精製は大腸菌を破砕後、NiカラムによりHisタグの親和性を利用して行ったが、さらに、CM-sepharoseカラム、mono-Sカラムによる分離精製をおこなった。この結果、収量は1リットルの培養液から数mgと減少したが、精製試料のイオン強度を高めておくと2週間では電気泳動的には変化しないことが確認できた。現在、クリスタル・スクリーンを利用して結晶化を試みている。

Routine liver に お け る tissue damage は liver cells raised colonization factor (HGF) が HGF 応 answer cells (epithelial) に す る let body に combining し, そ の intelligence を 伝 da す る こ と に よ っ て cell division を lead き up こ し repair す る. こ の process に お い て Hrs (HGF - regulated tyrosine kinase substrate) は Hbp と の complex の form で vesicular の budding, transmission and fusion に masato and し て い る こ と が in stopping さ れ て い る. This study で は Hrs の function を interpret す る た め, そ purpose decision を の structure と し, 発 is の 検 line for を っ た. domain,Proline rich region,Coiled coil motifやP/Q rich regionを って って る る. そ の 発 now は GST タ グ を N terminal に plus し た で, ベ ク タ ー と し て pGEX - 4 t - 2 を with い coliform に よ り whole structure に つ い て try み た が, GST affinity カ ラ ム に よ り refined し た after に も, cutting さ れ た の small molecular weight さ い が く し, more protein molecules 発 now し が た enzyme decomposition し て Youdaoplaceholder0 る とを shows た. こ の た め, VHS ド メ イ ン や FYVE ド メ イ ン か ら な る at the end of the function of interests deep い に N ド メ イ ン (253 residues, HrsN) の 発 line now を い refined し た が, refined the が time の 経 too と と も に decomposition す る こ と が 観 measuring さ れ た. こ れ は GST タ グ の molecular weight と HrsN molecular weight が ほ ぼ etc し く な り そ の influence で あ る こ と が suspense さ れ た の で タ グ を ihs タ グ に exchange し て 発 fasten now を group stand て 発 now さ せ た. Refined は coliform を broken after 砕, Ni カ ラ ム に よ り ihs タ グ の affinity を using し て line っ た が, さ ら に, CM sepharose カ ラ ム, mono - S カ ラ ム に よ る separation of refined を お こ な っ た. こ の results, 収 は 1 リ ッ ト ル の culture か ら several mg と reduce し た が, refined sample の イ オ ン strength を high め て お く と 2 weeks between で は electric 気 swimming に は variations change し な い こ と が confirm で き た. Now, リスタ リスタ ス · ス リ リ リ を を を use the <s:1> て crystallization を to try みて る る る.

项目成果

H. Hamada et al.: "Medium temperature, 310K, provides single crystal of orotate phosphoribosyltransferase from thermus thermophilus"Acta Crystallogrphica. D55. 345-346 (1999)

H. Hamada 等人：“中温，310K，提供了来自嗜热栖热菌的乳清酸磷酸核糖基转移酶的单晶”Acta Crystallogrphica。

S. Akanuma: "Further improvement of the thermal stability of a partially Stabilized B subtilis 3-isopropylmalate dehydrogenase variant by random and site-directed mutagenesis"Eur. J. Biochem.. 260. 499-504 (1999)

S. Akanuma：“通过随机和定点诱变进一步提高部分稳定的枯草芽孢杆菌 3-异丙基苹果酸脱氢酶变体的热稳定性”Eur。

Takata H et al.: "A Hrs binding protein having a Src homology 3 domain is involved in intracellular degradation of growth factors and their receptors"Genes Cells.. 1. 57-69 (2000)

Takata H 等人：“具有 Src 同源性 3 结构域的 Hrs 结合蛋白参与生长因子及其受体的细胞内降解”Genes Cells.. 1. 57-69 (2000)