モノクローナル抗体lot1抗原分子のクローニングおよび構造決定

单克隆抗体lot1抗原分子的克隆及结构测定

• 批准号: 11170221
• 负责人: 平田 たつみ
• 金额: $ 3.97万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11170221/
• 关键词: 軸索ガイド; lot細胞; モノクローナル抗体; 神経発生; 発現スクリーニング; 嗅索; lot1; 軸索ガイダンス

嗅球の軸索は、発生時、終脳の非常に狭い領域を選択的に伸長し、嗅索と呼ばれる軸索束を作り上げる。我々の作成したモノクローナル抗体lot1は、嗅球軸索の伸長に先だって、この軸索が将来伸長することになる経路に帯状に結合する。伸長してきた軸索は、この抗体で染色させる経路を正確に選んで伸長し、軸索伸長が終了すると同時に抗体による染色性は認められなくなる。すなわち、この抗体の抗原分子(lot1抗原)の時間的空間的な分布は、僧帽細胞の軸索伸長パターンと非常によく一致している。これまでにこのような発現パターンを示す分子は全く報告されておらず、lot抗原が僧帽細胞軸索ガイドに関与する可能性が期待できる。そこで本研究ではlot抗原のクローニングをめざした。当初lot1抗体を用いた免疫沈降により、抗原分子の同定を試みたが、失敗に終わった。western blottingでも反応物が検出できない事も考え合わせると、lot抗体は界面活性剤に非耐性のエピトープを認識している可能性が考えられた。そこで、蛋白質を本来の構造に近い形で発現することができる哺乳類培養細胞を用いて、cDNA発現スクリーニングを行った。lot1抗原を最も豊富に発現するマウス胎生14.5日目胚の副嗅球からmRNAを調製し、cDNAを合成して、哺乳類細胞発現用ベクターpCAGGSに組み込んだ。このcDNAライブラリーを約100クローンのプールに分割し、それぞれをCOS7細胞にトランスフェクションして蛋白質を発現させ、モノクローナル抗体lot1で染色して陽性の細胞を検索した。約20万クローンをスクリーニングしたところ、強陽性の細胞を生じる1プールを同定することができた。このプールをさらに分割してトランスフェクションを繰り返し、最終的にlot1抗体に反応する膜蛋白質をコードしたcDNAクローン1種類を単離した。このクローンの詳細については、現在解析中である。

当嗅球的轴突选择性地延长了端脑的非常狭窄的区域时，会产生称为嗅觉索的轴突束。我们的单克隆抗体lot1以纬向形式结合，与嗅球轴突延伸之前将来会延伸的途径。精确选择扩展的轴突以扩展使用该抗体染色的途径，并且一旦完成轴突延伸，就不再观察到抗体染色。也就是说，该抗体的抗原分子（LOT1抗原）的时间和空间分布与二尖瓣细胞的轴突延伸模式非常吻合。迄今为止，尚无据报道表现出这种表达模式的分子，预计批次抗原可能与二尖瓣细胞轴突指南有关。因此，这项研究旨在克隆地块抗原。最初，试图通过使用Lot1抗体进行免疫沉淀来鉴定抗原分子，但失败了。考虑到即使使用蛋白质印迹也无法检测到反应物，因此认为批次抗体可能会识别出对表面活性剂无抗的表位。因此，使用培养的哺乳动物细胞进行cDNA表达筛选，能够以类似于其原始结构的形式表达蛋白质。从小鼠胚胎第14.5天胚胎胚胎的辅助球制备mRNA，该胚胎胚胎最丰富地表达Lot1抗原，并合成cDNA并合成并掺入哺乳动物细胞表达载体PCAGG中。该cDNA文库分为大约100个克隆的池，每个克隆都被转染到COS7细胞中以表达蛋白质，并用单克隆抗体Lot1染色以寻找阳性细胞。筛选了大约200,000个克隆，并确定了一个强阳性细胞池。将该池进一步划分并重复转染，并最终分离出一种对lot1抗体反应的膜蛋白的cDNA克隆。该克隆的详细信息目前正在分析中。

项目成果

T.Hirata and H.Fujisawa: "Envitronmental control of collateral braching and target invasion of mitral cell axons during development."J.Neurobio1.. 38. 93-104 (1999)

T.Hirata 和 H.Fujisawa：“发育过程中二尖瓣细胞轴突的侧支分支和目标入侵的环境控制。”J.Neurobio1.. 38. 93-104 (1999)

Tomioka et al.: "Neocortical origin and tangential migration of guidepost neurons in the lateral olfactory tract"J.Neurosci.. 20. 5802-5812 (2000)

Tomioka 等人：“侧嗅束中路标神经元的新皮质起源和切向迁移”J.Neurosci.. 20. 5802-5812 (2000)

T.Hirata et al.: "Short-range guidance of olfactory bulb axons in independent of repulsive factor slit."J.Neurosci. (in press). (2001)

T.Hirata 等人：“嗅球轴突的短程引导与排斥因子狭缝无关。”J.Neurosci。

平田たつみ: "終脳における神経細胞の移動と領域特異化"細胞工学. (印刷中). (2001)

Tatsumi Hirata：“端脑神经元的迁移和区域规范”细胞工程（印刷中）。

平田たつみ, 佐藤泰史: "マウス終脳培養系を用いた軸策ガイダンス機構の解析"細胞工学. 18. 77-83 (1999)

Tatsumi Hirata、Yasushi Sato：“利用小鼠端脑培养系统分析轴突引导机制”《细胞工程》18. 77-83 (1999)。