モノクローナル抗体lot1抗原分子のクローニングおよび構造決定

单克隆抗体lot1抗原分子的克隆及结构测定

• 批准号: 11170221
• 负责人: 平田 たつみ
• 金额: $ 3.97万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11170221/
• 关键词: 軸索ガイド; lot細胞; モノクローナル抗体; 神経発生; 発現スクリーニング; 嗅索; lot1; 軸索ガイダンス

嗅球の軸索は、発生時、終脳の非常に狭い領域を選択的に伸長し、嗅索と呼ばれる軸索束を作り上げる。我々の作成したモノクローナル抗体lot1は、嗅球軸索の伸長に先だって、この軸索が将来伸長することになる経路に帯状に結合する。伸長してきた軸索は、この抗体で染色させる経路を正確に選んで伸長し、軸索伸長が終了すると同時に抗体による染色性は認められなくなる。すなわち、この抗体の抗原分子(lot1抗原)の時間的空間的な分布は、僧帽細胞の軸索伸長パターンと非常によく一致している。これまでにこのような発現パターンを示す分子は全く報告されておらず、lot抗原が僧帽細胞軸索ガイドに関与する可能性が期待できる。そこで本研究ではlot抗原のクローニングをめざした。当初lot1抗体を用いた免疫沈降により、抗原分子の同定を試みたが、失敗に終わった。western blottingでも反応物が検出できない事も考え合わせると、lot抗体は界面活性剤に非耐性のエピトープを認識している可能性が考えられた。そこで、蛋白質を本来の構造に近い形で発現することができる哺乳類培養細胞を用いて、cDNA発現スクリーニングを行った。lot1抗原を最も豊富に発現するマウス胎生14.5日目胚の副嗅球からmRNAを調製し、cDNAを合成して、哺乳類細胞発現用ベクターpCAGGSに組み込んだ。このcDNAライブラリーを約100クローンのプールに分割し、それぞれをCOS7細胞にトランスフェクションして蛋白質を発現させ、モノクローナル抗体lot1で染色して陽性の細胞を検索した。約20万クローンをスクリーニングしたところ、強陽性の細胞を生じる1プールを同定することができた。このプールをさらに分割してトランスフェクションを繰り返し、最終的にlot1抗体に反応する膜蛋白質をコードしたcDNAクローン1種類を単離した。このクローンの詳細については、現在解析中である。

Olfactory bulb の axon は, 発 when, 脳 の very に narrow い field を sentaku に elongation し, olfactory suo と shout ば れ る shaft SuoShu を made げ り る. I 々 の made し た モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody lot1 は, olfactory bulb axon の elongation に だ first っ て, こ の axon が future elongation す る こ と に な る 経 road に 帯 shape に combining す る. Elongation し て き た axon は, こ で の antibody staining さ せ る 経 を に choose right ん で す end of the elongation, axon elongation が し る と and に antibodies に よ る dyeing は recognize め ら れ な く な る. の す な わ ち, こ の antibody antigen molecules (lot1 antigen) の time space distribution of な は, mitral cells の axon elongation パ タ ー ン と very に よ く consistent し て い る. こ れ ま で に こ の よ う な 発 now パ タ ー ン を す in molecular は く report all さ れ て お ら ず, lot of antigen が mitral cell axon ガ イ ド に masato and す る possibility が expect で き る. Youdaoplaceholder0 で で in this study, で そ lot antigens are based on <s:1> ロ ニ ニ グをめざ グをめざ た た. At the beginning, the lot1 antibody was を immunodegraded by を た and によ, and the antigen molecule was <s:1> co-determined を. The test みたが failed and に eventually わった. Western blotting で も anti 応 content が 検 out で き な い matter も exam え close わ せ る と, lot antibody は interface active tonic に not patience の エ ピ ト ー プ を know し て い る possibility が exam え ら れ た. そ こ で, protein を に nearly い の structure form originally で 発 now す る こ と が で き る mammals culture cell を with い て, cDNA 発 now ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. Lot1 antigen を も most aboundant に 発 now す る マ ウ ス viviparous 14.5 day eye embryo の vice olfactory bulb か ら mRNA を modulation し, cDNA を synthetic し て, mammalian cell 発 current ベ ク タ ー pCAGGS に group み 込 ん だ. こ の cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を about 100 ク ロ ー ン の プ ー ル に し, そ れ ぞ れ を COS7 cell に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し て protein を 発 now さ せ, モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody lot1 で dyeing し て positive cells の を 検 cable し た. About 200000 ク ロ ー ン を ス ク リ ー ニ ン グ し た と こ ろ, strong positive cells の を じ る 1 プ ー ル を with fixed す る こ と が で き た. こ の プ ー ル を さ ら に segmentation し て ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン を Qiao り return し, eventually に に lot1 antibodies against 応 す る membrane protein を コ ー ド し た cDNA ク ロ ー ン 1 species を 単 from し た. Youdaoplaceholder2 である ロ ロ て <s:1> detailed に である て て て, present in the analysis である.

项目成果

T.Hirata and H.Fujisawa: "Envitronmental control of collateral braching and target invasion of mitral cell axons during development."J.Neurobio1.. 38. 93-104 (1999)

T.Hirata 和 H.Fujisawa：“发育过程中二尖瓣细胞轴突的侧支分支和目标入侵的环境控制。”J.Neurobio1.. 38. 93-104 (1999)

Tomioka et al.: "Neocortical origin and tangential migration of guidepost neurons in the lateral olfactory tract"J.Neurosci.. 20. 5802-5812 (2000)

Tomioka 等人：“侧嗅束中路标神经元的新皮质起源和切向迁移”J.Neurosci.. 20. 5802-5812 (2000)

T.Hirata et al.: "Short-range guidance of olfactory bulb axons in independent of repulsive factor slit."J.Neurosci. (in press). (2001)

T.Hirata 等人：“嗅球轴突的短程引导与排斥因子狭缝无关。”J.Neurosci。

平田たつみ: "終脳における神経細胞の移動と領域特異化"細胞工学. (印刷中). (2001)

Tatsumi Hirata：“端脑神经元的迁移和区域规范”细胞工程（印刷中）。

平田たつみ, 佐藤泰史: "マウス終脳培養系を用いた軸策ガイダンス機構の解析"細胞工学. 18. 77-83 (1999)

Tatsumi Hirata、Yasushi Sato：“利用小鼠端脑培养系统分析轴突引导机制”《细胞工程》18. 77-83 (1999)。