心筋細胞興奮性の遺伝子工学的制御-バイオペースメーカーの可能性の探求

当初計画していた、Kir2.1チャネルのアンチセンスをリポフェクチンを用いて心房筋に導入する方法は、細胞内への導入効率が非常に悪いため、Kir2.1チャネルのドミナントネガティブ突然変異体遺伝子(チャネルイオン孔領域にあるK^+イオン選択フィルタ部分のGYG motifをすべてアラニンで置換したKir2.1-AAA)を作成し、アデノウイルスを用いて導入する方法に変更した。野生型および突然変異体Kir2.1チャネルの細胞内における局在性を調べるためにKir2.1チャネルを緑色蛍光色素(GFP)で標識し、HEK293cellに発現させその局在性を確認したところ、野生型、突然変異体および共発現時いずれの場合も細胞膜に沿って発現しているのが観察された。次にKir2.1-AAAの野生型チャネルに対する効果を調べるために野生型およびAAA突然変異体のcRNAを作成し、アフリカツメガエル卵母細胞に注入した。その結果、野生型とAAA突然変異体を共発現させたグループでは野生型のみを注入したグループに比べ、Kir2.1電流は60%減弱していた(野生型:AAA変異体=1:5注入時)。現在、Kir2.1-AAAcDNAを組み込んだアデノウイルスを作成しており、組み込みが確認され次第培養心房筋細胞にKir2.1-AAA遺伝子を導入し、その効果-特に自動能の変化について調べる。また、申請時の内容に沿い、遺伝子導入した培養心房筋細胞を成熟マウス心に移植し、その効果を調べる予定である。

当初計画していた、Kir2.1チャネルのアンチセンスをリポフェクチンを用いて心房筋に導入する方法は、細胞内への導入効率が非常に悪いため、Kir2.1チャネルのドミナントネガティブ突然変異体遺伝子(チャネルイオン孔領域にあるK^+イオン選択フィルタ部分のGYG motifをすべてアラニンで置換したKir2.1-AAA)を作成し、アデノウイルスを用いて導入する方法に変更した。野生型および突然変異体Kir2.1チャネルの細胞内における局在性を調べるためにKir2.1チャネルを緑色蛍光色素(GFP)で標識し、HEK293cellに発現させその局在性を確認したところ、野生型、突然変異体および共発現時いずれの場合も細胞膜に沿って発現しているのが観察された。次にKir2.1-AAAの野生型チャネルに対する効果を調べるために野生型およびAAA突然変異体のcRNAを作成し、アフリカツメガエル卵母細胞に注入した。その結果、野生型とAAA突然変異体を共発現させたグループでは野生型のみを注入したグループに比べ、Kir2.1電流は60%減弱していた(野生型:AAA変異体=1:5注入時)。現在、Kir2.1-AAAcDNAを組み込んだアデノウイルスを作成しており、組み込みが確認され次第培養心房筋細胞にKir2.1-AAA遺伝子を導入し、その効果-特に自動能の変化について調べる。また、申請時の内容に沿い、遺伝子導入した培養心房筋細胞を成熟マウス心に移植し、その効果を調べる予定である。