DNAの核移行を制御する諸因子の解析

DNA核易位控制因素分析

• 批准号: 11877389
• 负责人: 伊藤 文昭
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Setsunan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11877389/
• 关键词: 核移行; DNA; MNB蛋白質; 遺伝子導入; ジギトニン処理細胞; マイクロインジェクション

遺伝子を細胞内に導入するトランスフェクション法は、遺伝子の機能解析のための有用な技術の一つである。しかしながら、トランスフェクション法は必ずしも成功するとは限らず、努力をしたにもかかわらず目的とした遺伝子を発現した細胞が得られないケースも多い。この理由の一つとして、細胞質から核にDNAが移行するステップの効率の低いこと考えられる。しかしながら、DNAの核移行は生理的条件下では殆ど起きないこともあり、研究者の注意を惹いてこなかった。本研究では、このような現状を鑑み、DNAの核移行メカニズムを明らかにする目的で以下の実験を行った。蛋白質の核移行に関しては分子レベルの解析が進み、多くのことが明らかになっている。そこで、DNAを用いて核移行を調べる前に、核移行シグナルを有し、核局在が明らかになっている蛋白質リン酸化酵素MNBを用いて、核移行を測定するための実験系の確立を試みた。MNB蛋白質はチオレドキシン融合蛋白質として大腸菌に発現させ、チオボンド樹脂およびニッケル樹脂によるアフィニティー精製(MNBはヒスチジンリピートを有している)により精製した。ラット副腎髄質クロム親和性細胞腫から株化されたPC12細胞を、コラーゲンコートしたカバースリップ上に増殖させ、ジギトニン処理をすることにより細胞膜を高分子が透過できるようにした。さらに、精製MNB蛋白質を添加した後、抗MNB抗体を用いて蛍光顕微鏡により核移行を調べた。蛍光が核に認められることから、MNB蛋白質の核局在が確認されたが、ATP非存在下あるいは4℃においても核に蛍光が認められた。現在、ジギトニン濃度などを検討して、温度依存的に核移行が起きる条件を検討している。また、マイクロインジェクション法によりDNAおよび精製MNB蛋白質を細胞質に直接注入する実験を行なうなど、ジギトニン処理細胞を用いた方法以外についても検討している。

A new method for gene introduction into cells and useful techniques for gene function analysis The law of the land is not to be ignored. The law of the land is to be ignored. One of the reasons for this is the low efficiency of staffers because of the migration of DNA between the cytoplasm and the nucleus. DNA nuclear migration under physiological conditions The purpose of this study is to identify the status quo of DNA and DNA nuclear migration. Protein nuclear migration is related to molecular analysis and analysis. In addition, the use of DNA in the regulation of nuclear migration, nuclear migration, nuclear DNA in the future, protein acidification enzyme MNB, nuclear migration determination, and the establishment of a system of experiments MNB protein is purified from E. coli, produced from E. coli, and produced from E. coli. The cell membrane of PC12 cells is permeable to high molecular weight. After the addition of purified MNB protein, anti-MNB antibodies were used to modulate nuclear migration. In the absence of ATP, the protein of MNB is recognized by the nucleus. Now, the temperature dependent nuclear migration conditions are discussed. DNA and purified MNB protein were injected directly into the cytoplasm of the cells.