クローン動物作出のための移植核リプログラミング因子の同定と解析

用于生产克隆动物的移植核重编程因子的鉴定和分析

• 批准号: 11878169
• 负责人: 笠井 憲雪
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11878169/
• 关键词: クローン; リプログラミング; メチル化; サブトラクション; demethylase

分化した細胞核を移植するクローン動物作出では、正常な初期胚発生を行うには、発生過程に必要な遺伝子群が発現する状態にならなければならない。このような遺伝子発現の多様性を取り戻すためのリプログラミング因子を同定することは、クローン動物を効率よく作出するために重要と考えられる。正常の初期胚発生過程においてDNAメチル化パターンが大きく変化することが報告されており、我々はリプログラミング因子の一つとして、脱メチル化修飾を行う遺伝子の存在を想定した。本研究では脱メチル化遺伝子を最終的に単離する目的で、DNAメチル化パターンの異なる4細胞期胚と桑実期胚からRNAを分離し、サブトラクション法を用いて発現差異を示す遺伝子の網羅的探索を行った。337個の4細胞期胚、214個の桑実期胚からIsogenを用いてtotal RNAを抽出した。抽出されたtotal RNAは各サンプル共に50ng以下と微量ではあったが、このRNAを鋳型としてSMART PCR cDNA Synthesis Kitを用い、cDNAの合成、増幅を行った。4細胞期胚、桑実期胚から合成されたcDNAをそれぞれTester cDNA、Driver cDNAとしてPCR-Select cDNA Subtraction Kitを使用してサブトラクションを行った。特異的に発現するcDNAを選択的に増幅するために、1st、2nd PCRを行うことにより400bp長を中心としたPCR産物が得られ、これらをTAクローニングベクターに挿入しサブトラクションcDNAライブラリーの作成に成功した。現在までランダムに48個のクローンを選定し解析を行った結果、200bp長以上のインサートを含むクローン(14個)において新規の遺伝子は確認されていないが、本研究により作成されたcDNAライブラリーは新規遺伝子探索の基礎になるものと考えられた。

The differentiation of the nuclei, the transplantation of the nuclei, the induction of the animals, the birth of the embryos in the early stage of the normal pregnancy, and the necessary subgroups in the course of the birth process were observed. Please tell me that there is a lot of information about how much you want to know. You need to know that the factors are the same as those of you. You know, you know, it's important to know In the normal early stage of pregnancy, there is an error in the process of DNA treatment. There is a situation in which there is an error in the report, one of the factors, and one of the major factors. The purpose of this study is to identify the most important targets of the virus, the DNA gene, the 4-cell embryo, the mulberry embryo, the RNA, and the detection method to show the exploration of the sub-network. 337 4-cell stage embryos and 214 mulberry stage embryos were extracted from Isogen embryos by total RNA. Extract the following trace amounts of total RNA, RNA, SMART PCR cDNA Synthesis Kit, cDNA, and line in each 50ng. 4. Cell stage embryos, mulberry stage embryos were synthesized, cDNA embryos were synthesized, Tester cDNA, Driver cDNA embryos PCR-Select cDNA Subtraction Kit were used. In the special "cDNA" option, you can see that the frames, 1st, and 2nd PCR lines do not show that the 400bp long-term center has received a lot of damage from the PCR object, and that you have made a success call because you have received a lot of information from the 400bp center. At present, 48 government departments have been selected to analyze the results of the analysis of the results, and 14 of the 200bp operators have confirmed that the new regulations are valid, and this study has been conducted to verify that the new rules and regulations are not valid. In this study, we have completed a test on how to explore the basic database of the new rules and regulations of cDNA.