クローン動物作出のための移植核リプログラミング因子の同定と解析

分化した細胞核を移植するクローン動物作出では、正常な初期胚発生を行うには、発生過程に必要な遺伝子群が発現する状態にならなければならない。このような遺伝子発現の多様性を取り戻すためのリプログラミング因子を同定することは、クローン動物を効率よく作出するために重要と考えられる。正常の初期胚発生過程においてDNAメチル化パターンが大きく変化することが報告されており、我々はリプログラミング因子の一つとして、脱メチル化修飾を行う遺伝子の存在を想定した。本研究では脱メチル化遺伝子を最終的に単離する目的で、DNAメチル化パターンの異なる4細胞期胚と桑実期胚からRNAを分離し、サブトラクション法を用いて発現差異を示す遺伝子の網羅的探索を行った。337個の4細胞期胚、214個の桑実期胚からIsogenを用いてtotal RNAを抽出した。抽出されたtotal RNAは各サンプル共に50ng以下と微量ではあったが、このRNAを鋳型としてSMART PCR cDNA Synthesis Kitを用い、cDNAの合成、増幅を行った。4細胞期胚、桑実期胚から合成されたcDNAをそれぞれTester cDNA、Driver cDNAとしてPCR-Select cDNA Subtraction Kitを使用してサブトラクションを行った。特異的に発現するcDNAを選択的に増幅するために、1st、2nd PCRを行うことにより400bp長を中心としたPCR産物が得られ、これらをTAクローニングベクターに挿入しサブトラクションcDNAライブラリーの作成に成功した。現在までランダムに48個のクローンを選定し解析を行った結果、200bp長以上のインサートを含むクローン(14個)において新規の遺伝子は確認されていないが、本研究により作成されたcDNAライブラリーは新規遺伝子探索の基礎になるものと考えられた。

分化した細胞核を移植するクローン動物作出では、正常な初期胚発生を行うには、発生過程に必要な遺伝子群が発現する状態にならなければならない。このような遺伝子発現の多様性を取り戻すためのリプログラミング因子を同定することは、クローン動物を効率よく作出するために重要と考えられる。正常の初期胚発生過程においてDNAメチル化パターンが大きく変化することが報告されており、我々はリプログラミング因子の一つとして、脱メチル化修飾を行う遺伝子の存在を想定した。本研究では脱メチル化遺伝子を最終的に単離する目的で、DNAメチル化パターンの異なる4細胞期胚と桑実期胚からRNAを分離し、サブトラクション法を用いて発現差異を示す遺伝子の網羅的探索を行った。337個の4細胞期胚、214個の桑実期胚からIsogenを用いてtotal RNAを抽出した。抽出されたtotal RNAは各サンプル共に50ng以下と微量ではあったが、このRNAを鋳型としてSMART PCR cDNA Synthesis Kitを用い、cDNAの合成、増幅を行った。4細胞期胚、桑実期胚から合成されたcDNAをそれぞれTester cDNA、Driver cDNAとしてPCR-Select cDNA Subtraction Kitを使用してサブトラクションを行った。特異的に発現するcDNAを選択的に増幅するために、1st、2nd PCRを行うことにより400bp長を中心としたPCR産物が得られ、これらをTAクローニングベクターに挿入しサブトラクションcDNAライブラリーの作成に成功した。現在までランダムに48個のクローンを選定し解析を行った結果、200bp長以上のインサートを含むクローン(14個)において新規の遺伝子は確認されていないが、本研究により作成されたcDNAライブラリーは新規遺伝子探索の基礎になるものと考えられた。