ランダムサイトコドン変異法による非天然アミノ酸導入蛋白質の作製

使用随机位点密码子诱变方法生产非天然氨基酸引入的蛋白质

基本信息

批准号：
00J06468
负责人：
村上裕
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J06468/
关键词：
非天然アミノ酸セレクション蛋白質リボザイム進化工学コドン RNA tRNA

项目摘要

非天然アミノ酸の蛋白質への部位特異的導入は、蛋白質に新たな機能を付与するための有用な方法である。この変異法は1989年にShultzらにより、アンバーコドンを非天然アミノ酸に対応させる方法として発表された。我々の研究室では、新しく4塩基や5塩コドンを非天然アミノ酸に対応させることで、非天然アミノ酸の導入効率を改善し、さらには2個の非天然アミノ酸を導入して蛋白内の電子移動を観測することにも成功している(J.A.C.S. 2002)。しかし、非天然アミノ酸でアシル化されたtRNAの作成が非常に複雑であるため、その応用には限界があるのも事実である。本年度は、アミノアシルtRNAの簡便な作成法を開発するべく、ニュヨーク州立大学の菅裕明教授との共同研究を行った。菅裕明教授は、tRNAをアミノアシル化する様々なリボザイム(RNA触媒)を、進化工学的手法を用いて得ている。このうち、r24と名付けられたリボザイムは、カルボキシル基を弱く活性化したアミノ酸を基質としtRNAの3'末端を特異的にアミノアシル化する。しかし、r24はtRNAと強く結合し、生成物であるアミノアシルtRNAを解離することができず、結果として1ターンオーバーの触媒となる。この問題点を逆手に取り、r24をレジンに固定化することで効率良くアミノアシルtRNAを作成し精製することに成功した。実際には、r24の3'末端にpolyAを付加し、この3'末端を酸化してジアルデヒドを作成し、これをヒドラジドを表面にもつレジンに固定化した。このr24を固定化したレジンにtRNAとアミノ酸を含む水溶液を加え、アミノアシル化反応を行った。反応後、レジンを洗浄し、尿素を含む溶出液でr24を変性させることで、アミノアシルtRNAが回収できた。さらに、r24を固定化したレジンは、水で洗浄するだけで簡単に再生でき、複数回の再利用が可能であった。本結果は本年度の(H. M. et al. JA.CS. 2002)に発表した。今後、本方法が「ランダム挿入削除変異法(ランダムサイトコドン変異法)」を含む様々な方法に応用されるものと考えられる。

特定于位点的非天然氨基酸在蛋白质中引入是一种有用的方法，用于将新功能赋予蛋白质。 Shultz等人于1989年发表了这种突变方法。作为制造琥珀色密码子的方法，对应于非天然氨基酸。我们的实验室通过使用新的四碱基和五盐密码子与非天然氨基酸匹配的新实验室成功提高了非天然氨基酸的效率，并还引入了两个非天然氨基酸来观察蛋白质中的电子转移（J.A.C.S. 2002）。但是，确实，用不自然的氨基酸的TRNA酰化的TRNA酰化非常复杂，并且其应用是有限的。今年，我们与纽约州立大学的Suga Hiroaki教授进行了联合研究，以开发一种创建氨基酰基tRNA的简单方法。 Suga Hiroaki教授已经获得了使用进化工程技术的各种核酶（RNA催化剂）。其中，称为R24的核酶使用具有弱活化的羧基的氨基酸作为底物，并特别是氨基酰基的氨基酸，将tRNA的3'末端定为氨基酸。但是，R24与tRNA强烈结合，无法解离产物氨基酰基tRNA，从而导致一个失误催化剂。利用这个问题，我们成功地通过将R24固定在树脂上来有效地创建和净化氨基酰基tRNA。实际上，将Polya添加到R24的3'末端，并将3'端氧化以形成二醛，并在其表面上固定在树脂上，并将其固定在树脂上。将含有tRNA和氨基酸的水溶液与固定的R24一起添加到树脂中，并进行氨基酰化反应。反应后，将树脂洗涤并用含有尿素的洗脱液变性，从而恢复了氨基酰基tRNA。此外，只需用水洗涤就可以很容易地再生带有R24的树脂，并且可以多次重复使用。这些结果今年发表（H.M.等人JA.CS. 2002）。人们认为，该方法将以多种方式应用，包括“随机插入和缺失突变方法（随机位点密码子突变方法）”。将来。