ランダムサイトコドン変異法による非天然アミノ酸導入蛋白質の作製

使用随机位点密码子诱变方法生产非天然氨基酸引入的蛋白质

• 批准号: 00J06468
• 负责人: 村上 裕
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J06468/
• 关键词: 非天然アミノ酸; セレクション; 蛋白質; リボザイム; 進化工学; コドン; RNA; tRNA

非天然アミノ酸の蛋白質への部位特異的導入は、蛋白質に新たな機能を付与するための有用な方法である。この変異法は1989年にShultzらにより、アンバーコドンを非天然アミノ酸に対応させる方法として発表された。我々の研究室では、新しく4塩基や5塩コドンを非天然アミノ酸に対応させることで、非天然アミノ酸の導入効率を改善し、さらには2個の非天然アミノ酸を導入して蛋白内の電子移動を観測することにも成功している(J.A.C.S. 2002)。しかし、非天然アミノ酸でアシル化されたtRNAの作成が非常に複雑であるため、その応用には限界があるのも事実である。本年度は、アミノアシルtRNAの簡便な作成法を開発するべく、ニュヨーク州立大学の菅裕明教授との共同研究を行った。菅裕明教授は、tRNAをアミノアシル化する様々なリボザイム(RNA触媒)を、進化工学的手法を用いて得ている。このうち、r24と名付けられたリボザイムは、カルボキシル基を弱く活性化したアミノ酸を基質としtRNAの3'末端を特異的にアミノアシル化する。しかし、r24はtRNAと強く結合し、生成物であるアミノアシルtRNAを解離することができず、結果として1ターンオーバーの触媒となる。この問題点を逆手に取り、r24をレジンに固定化することで効率良くアミノアシルtRNAを作成し精製することに成功した。実際には、r24の3'末端にpolyAを付加し、この3'末端を酸化してジアルデヒドを作成し、これをヒドラジドを表面にもつレジンに固定化した。このr24を固定化したレジンにtRNAとアミノ酸を含む水溶液を加え、アミノアシル化反応を行った。反応後、レジンを洗浄し、尿素を含む溶出液でr24を変性させることで、アミノアシルtRNAが回収できた。さらに、r24を固定化したレジンは、水で洗浄するだけで簡単に再生でき、複数回の再利用が可能であった。本結果は本年度の(H. M. et al. JA.CS. 2002)に発表した。今後、本方法が「ランダム挿入削除変異法(ランダムサイトコドン変異法)」を含む様々な方法に応用されるものと考えられる。

site-specific introduction of non-natural acid and protein, and useful methods for imparting new protein functions This method was developed by Shultz in 1989. Our laboratory has successfully tested the electron mobility in proteins by introducing two unnatural acids into the protein.(J.A.C.S.) 2002)。This is not a natural acid. It's not a natural acid. It's a natural acid. This year, a joint research project was conducted by Professor Yu Ming Kan of the State University to develop a simple method for the production of RNA. Professor Yuming Suga uses evolutionary engineering methods to develop the concept of tRNA (RNA catalyst). The r24 gene is also called the "r24 gene." The r24 gene is called the "r24 gene." The r24 gene is called the "r24 gene." r24 is strongly bound to tRNA, the product is dissociated from tRNA, and the result is a catalyst. The problem is that the r24 is immobilized. In fact, the 3'end of r24 was added with polyA, and the 3' end was acidified to form a surface layer, which was immobilized on the surface layer. The r24 was immobilized and the tRNA was added to the aqueous solution. After the reaction, the solution was washed, and the urea solution was dissolved in r24. In addition, r24 is immobilized and washed with water. It is possible to regenerate and reuse it in multiple ways. The results of this year are reversed (H. M. et al. JA.CS. 2002). From now on, this method includes the following methods:

项目成果

Masumi Taki, Takahiro Hohsaka, Hiroshi Murakami, Kazunari Taira, Masahiko Sisido: "Position-specific incorporation of a fluorophore-quencher pair into a single streptavidin through orthogonal four-base codon/anticodon pairs"J. Am. Chem. Soc.. 124・49. 1458

Masumi Taki、Takahiro Hohsaka、Hiroshi Murakami、Kazunari Taira、Masahiko Sisido：“通过正交四碱基密码子/反密码子对将荧光团淬灭剂对定位到单个链霉亲和素中”J. Soc. 124。・49.1458

Hiroshi Murakami, Neil Bonzagni, Hiroaki Suga: "Aminoacyl-tRNA Synthesis by a Resin-Immobilized Ribozyme"J. Am. Chem. Soc.. 124・24. 6834-6835 (2002)

Hiroshi Murakami、Neil Bonzagni、Hiroaki Suga：“树脂固定核酶的氨基酰基-tRNA 合成”J. Am. 124・24 (2002)。

Hiroshi Murakami, Takahiro Hohsaka, Kazunari Taira, Masahiko Sisido: "Random Insertion and Deletion Mutagenesis"Methods in Molecular Biology. (in press).

Hiroshi Murakami、Takahiro Hohsaka、Kazunari Taira、Masahiko Sisido：“随机插入和缺失突变”分子生物学方法。

村上裕, 芳坂貴弘, 宍戸昌彦: "新規変異タンパク質創出のためのランダム挿入削除変異法"BIOベンチャー. 2・4. 94-97 (2002)

Yutaka Murakami、Takahiro Yoshisaka、Masahiko Shishido：“用于创建新型突变蛋白的随机插入/缺失诱变方法”BIO Venture 94-97（2002）。