新規アミノアシルtRNA合成リボザイムの創製

新型氨酰基-tRNA合成核酶的创建

基本信息

批准号：
17750151
负责人：
村上裕
金额：
$ 2.3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17750151/
关键词：
アミノアシルtRNA リボザイム翻訳非天然アミノ酸試験管内進化

项目摘要

非天然アミノ酸変異法は、人工的な官能基を蛋白質に部位特異的に導入する優れた方法である。この変異法にはアシルtRNAの合成が必須であり、我々はリボザイムを人工的に進化させることでアシルtRNAの合成を簡便化することを提案してきた。これまでに試験管内分子進化により創製したRNA触媒を用いて、Phe誘導体でアシル化されたtRNAの合成に成功している。本課題では、RNA触媒を進化させ、本方法をPhe誘導体以外の非天然アミノ酸に拡張することを目的とした。RNA触媒の基質となるアミノ酸は、カルボン酸をエステル化して弱く活性化したものを用いている。これまでの研究から、RNA触媒は基質の脱離基を認識せず、側鎖の芳香環を認識するため、側鎖に芳香環を持つアミノ酸のみがRNA触媒の基質となることが分かっていた。そこで、もしRNA触媒の基質認識部位を、側鎖から脱離基に変更できれば、様々な側鎖をもつアミノ酸をtRNAに連結することが可能になると考えた。この設計指針によって、脱離基に芳香環(認識部位)をもつ新しい基質を合成した。この基質は当初の考え通り、既存のRNA触媒の基質となったが、そのアシル化効率は低かった。そこで新しい基質に対してRNA触媒を最適化するため、試験管内進化を行なった。得られたRNA触媒は進化を行なう前のものに比べ、5倍以上の活性を持っていた。このRNA触媒と、脱離基に芳香環(認識部位)をもつ基質を用いることで、これまでの基質の制限を大幅に取り払ったtRNAアシル化法が完成した(Nat.Methods 2006)。今後、本方法によりアシルtRNAの合成が簡略化され、非天然アミノ酸を用いた蛋白質の改変が容易になると考えられる。さらには、RNA触媒を遺伝暗号のリプログラミングと組み合わせ、非天然型ペプチドを調整することで、革新的な創薬技術の開発に応用できると期待される。

非天然氨基酸突变方法是将人工官能团特异性引入蛋白质的极好方法。这种突变方法需要合成酰基TRNA，我们提出人为地进化的核酶来简化酰基TRNA的合成。迄今为止，使用通过测试管中的分子进化产生的RNA催化剂成功合成了用PHE衍生物酰化的TRNA。该主题旨在进化RNA催化剂并将方法扩展到PHE衍生物以外的非天然氨基酸。用作RNA催化剂的氨基酸是通过羧酸酯化而弱激活的氨基酸。先前的研究表明，RNA催化剂无法识别出底物中的组并识别侧链中的芳族环，因此只有侧链中的芳族环的氨基酸才能成为RNA催化剂的底物。因此，我们认为，如果可以将RNA催化剂的底物识别位点从侧链更改为离开组，则可以将具有各种侧链的氨基酸连接到tRNA。该设计指南用于合成带有芳环（识别位点）的新基板。正如最初认为的那样，该底物成为现有RNA催化剂的底物，但其酰化效率较低。因此，进行体外进化以优化新底物的RNA催化剂。获得的RNA催化剂的活性比进化前的活性高五倍以上。通过将此RNA催化剂和带有芳环（识别位点）的底物作为离开组，一种tRNA酰化方法可显着消除底物的限制（Nat。方法2006）。人们认为，该方法将简化酰基TRNA的合成，并使用非天然氨基酸促进蛋白质的修饰。此外，通过将RNA催化剂与遗传代码的重编程和调整非天然肽的重编程相结合，可以预期它们可以应用于创新的药物发现技术的开发。