低分子G蛋白質ARF依存性ホスホリパーゼDの活性化機構の解析

小G蛋白ARF依赖性磷脂酶D激活机制分析

• 批准号: 10212206
• 负责人: 中村 俊一
• 金额: $ 24.83万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10212206/
• 关键词: ホスホリパーゼD; G_<M2>アクチベーター; ADPリボシル化因子; プロテイン・キナーゼC; ホスファチジルコリン; ホスファチジルイノシトール4,5二リン酸; ADP-リボシル化因子; 細胞内情報伝達; コリン燐脂質; ADP―リボシル化因子

我々はこれまでG_<M2>アクチベーターによるホスホリパーゼD1(PLD1)の活性調節機構について報告してきた。本年度はこの研究計画の最終年度にあたることを鑑み、総括的な観点からPLDの活性化機構を調べる目的で、比較的研究の遅れているPLD2に焦点を絞り競究をおこなった.PLD2はPLD1と異なりARFやPKCαにより活性化されず、その活性化機構に関しては不明であった。そこで我々はG_<M2>アクチベーターによるPLD2の活性調節の有無を調べるため、リコンビナントPLD2を作成しこの精製タンパク質を用いてin vitroに於けるPLDの活性測定を行った。その結果、我々が開発した硫酸アンモニウムを用いたPLD活性測定法においてもBrownらの開発した活性測定法を用いても、PLD2はG_<M2>アクチベーターにより強力に(約5倍)活性化された。興味深いことに、PLD2の活性化には影響を与えないとされていたARFは単独ではPLD2を活性化しないが、G_<M2>アクチベーター存在下に於いてはPLD1と同様に相乗的にPLD2を活性化した。更に免疫沈降実験に於いて、G_<M2>アクチベーターとPLD2が結合すること。またG_<M2>アクチベーター存在下ではPLD2とARFの結合が亢進することが明らかにされた。今までPLD2はPIP_2存在下で高い活性を示すことから、細胞内では抑制的にその活性が調節され、細胞刺激の結果その抑制が解除され活性を発現すると考えられてきた。今回の我々の結果は、PLD2はPLD1と同様に、複数の活性化因子が組み合わさって活性化を引き起こすことが強く示唆された。以上の結果から、刺激に連動したPLD2の活性化機構解明には至らなかったものの、分子レベルに於けるPLD2の活性化機備の瑛解に大きな進展が見られたと言えよう。

I 々 は こ れ ま で G_ (M2 > ア ク チ ベ ー タ ー に よ る ホ ス ホ リ パ ー ゼ D1 (PLD1) の activity regulating mechanism に つ い て report し て き た. Research projects for this year's は こ の の final annual に あ た る こ と を み, 総 enclosed the な 観 point か ら PLD の activeness institutions を adjustable べ る purpose で, comparative studies の 遅 れ て い る PLD2 に focus を ground り race in を お こ な っ た. PLD2 は PLD1 と different な り ARF や PKC alpha に よ り activeness さ れ ず, そ の activeness institutions に masato Youdaoplaceholder0 て unknown であった. そ こ で I 々 は G_ (M2 > ア ク チ ベ ー タ ー に よ る PLD2 の active の presence of を adjustment べ る た め, リ コ ン ビ ナ ン ト PLD2 を made し こ の refined タ ン パ ク qualitative を with い て in vitro に in け る PLD の activity test line を っ た. そ の results, I 々 が open 発 し た sulfate ア ン モ ニ ウ ム を with い た PLD activity assay に お い て も Brown ら の open 発 し を た activity determination method with い て も, PLD2 は G_ (M2 > ア ク チ ベ ー タ ー に よ り powerful に (about 5 times) activeness さ れ た. Interest as deep い こ と に, PLD2 の activeness に は influence を and え な い と さ れ て い た ARF は 単 alone で は PLD2 を activeness し な い が, G_ < M2 > ア ク チ ベ ー タ ー presence に in い て は PLD1 と with others in に phase 乗 に PLD2 を activeness し た. More に immune sink be 験 に in い て, G_ (M2 > ア ク チ ベ ー タ ー と PLD2 が combining す る こ と. ま た G_ (M2 > ア ク チ ベ ー タ ー presence で は PLD2 と ARF の combining が hyperthyroidism す る こ と が Ming ら か に さ れ た. Today ま で PLD2 は PIP_2 で in the presence of high い activity を shown す こ と か ら, intracellular で は inhibition of に そ が の activity regulating さ れ, cells stimulate の results そ の inhibit が remove さ れ active を 発 now す る と exam え ら れ て き た. Today return my の 々 の results は, PLD2 は PLD1 と with others に, plural の activeness factor が group み わ さ っ て activeness を lead き up こ す こ と が く and shown strong sucking さ れ た. の above results か ら, stimulating に correlation し た PLD2 の activeness agencies interpret に は to ら な か っ た も の の, molecular レ ベ ル に in け る PLD2 の active mechanism for の ying solution に big き な progress が see ら れ た と said え よ う.

项目成果

Nakamura,S.: "Requirement of G_<M2> ganglioside activator for phospholipase D activation" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 95. 12249-12253 (1998)

Nakamura,S.：“磷脂酶 D 激活所需的 G_<M2> 神经节苷脂激活剂”Proc.Natl.Acad.Sci.USA。

Akisue,T.: "Purification of a heat-stable activator protein for ADP-ribosylation factor-dependent phospholipase D." FEBS Lett.422. 108-112 (1998)

Akisue,T.：“ADP-核糖基化因子依赖性磷脂酶 D 的热稳定性激活蛋白的纯化。”

Yoshida,H.: "Isolation and properties of a novel phospholipase A from rat brain that hydrolyses fatty acids at sn-1 and sn-2 positions." Annals Clin.Biochem.35. 295-301 (1998)

Yoshida,H.：“从大鼠脑中分离出一种新型磷脂酶 A，该酶可水解 sn-1 和 sn-2 位点的脂肪酸。”

Sarkar, S. et al.: "Regulation of mammalian phospholipase D2 : interaction with and stimulation by G_<M2> activator"Biochem. J.. 359. 599-604 (2001)

Sarkar，S.等：“哺乳动物磷脂酶D2的调节：与G_<M2>激活剂的相互作用和刺激”Biochem。

中村俊一: "ホスホリパーゼDの活性制御"蛋白質・核酸・酵素. 44. 1007-1012 (1999)

Shunichi Nakamura：“磷脂酶 D 活性的调节”蛋白质/核酸/酶。44。1007-1012 (1999)