古細菌コハク酸脱水素酵素複合体の構造機能解析

古菌琥珀酸脱氢酶复合物的结构和功能分析

• 批准号: 11169237
• 负责人: 岩崎 俊雄
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11169237/
• 关键词: コハク酸脱水素酵素; 呼吸鎖複合体II; 構造機能解析; 鉄硫黄クラスター; X線吸収スペクトル; 電子スピン共鳴; 酸化還元酵素; 結晶化; 古細菌

古細菌スルホロバスのコハク酸脱水素酵素複合体は、4つのサブユニットSdhA,B,C,Dからなり、高い耐熱性を有する。本研究では、古細菌型コハク酸脱水素酵素複合体の構造機能解析を目的として、以下の研究成果を得た。(i)全遺伝子配列決定と各サブユニットの系統解析から、SdhA,Bがミトコンドリア・真正細菌型であり、SdhCがメタン菌フマル酸:チオール酸化還元酵素サブユニットのホモログ、SdhDが新規タンパクであることを見出した。(ii)sdhA-D,sdhAB,sdhB,sdhC,sdhD遺伝子の大腸菌発現系をそれぞれ構築した。その結果、SdhCについては大量発現に成功し、さらにEXAFSおよび共鳴ラマン解析から、鉄および亜鉛を結合すること、少なくとも新規[2Fe-2S]クラスターを有することを見出した。また、EPR解析からSdhCに異方性の高いラジカル中心を見い出したが、同定には至っていない。SdhCは立体構造未知なため、発現酵素を用いた結晶化に着手した。(iii)sdhB遺伝子全長を含むコンストラクトは全て封入体となり、これはシャペロニンGroELSやチオレドキシンとの共発現系によっても状況が改善されなかった。本研究の成果は論文として発表した他、1報投稿中である。また、本課題と関連し、他の酸化還元酵素についても、EPR・EXAFSによる解析を行い、論文として発表した。今後はsdhA-D遺伝子の大腸菌発現系改変を試みるとともに、SdhCの結晶化・機能解析を引続き行う予定である。

Archaea spp. was characterized by acid dehydrase complex, 4-phenotypic acid dehydrase complex, SdhA,B,C,D virus, and high tolerance. In this study, the complex of acid dehydrase and archaic acid dehydrase can be used to analyze the target gene, and the following research results are satisfactory. (I) the configuration of the whole system determines that the real bacteria, SdhA,B bacteria, and SdhC bacteria can be determined by the whole system. The bacteria are acidified, the enzymes are acidified, the enzymes are not used, and the new rules and regulations of the SdhD are analyzed. (ii) sdhA-D,sdhAB,sdhB,sdhC,sdhD spores and bacteria are isolated from the bacteria. The results show that there are a large number of successful SdhC results, a large number of successful results, a large number of EXAFS results, a large number of successful results, a large number of The EPR parses the data from the SdhC to the center, and determines the location from the location to the location. SdhC stereospecific method was used to create an unknown enzyme, and the enzyme enzyme was crystallized by the method of crystallization. (iii) the full length of the sdhB system contains information on the total length of the system, including the total length of the system, the total length of the system. In this study, the results of this study are related to the results of this study and the results of this study. This topic is divided into three parts, namely, acidification of reductase, EPR ·EXAFS analysis, and text analysis. In the future, the sdhA-D spawn strain will be changed to the SdhC machine, and the computer will be able to analyze the predetermined data of the bank.

项目成果

Iwasaki,T. 他: "Sequence motif-specific assignment of two [2Fe-2S] clusters in rat xanthine oxidoreductase studied by site-directed mutagenesis."J.Biochem.. 127. 771-778 (2000)

Iwasaki, T. 等人：“通过定点诱变研究大鼠黄嘌呤氧化还原酶中两个 [2Fe-2S] 簇的序列基序特异性分配。J.Biochem.. 127. 771-778 (2000)”

Iwasaki, T.: "Respiratory complex II from the thermoacidophilic archaeon, Sulfolobus sp. Strain 7 : genes and protein"Flavins and Flavoproteins 1999. 779-781 (1999)

Iwasaki, T.：“嗜热嗜酸古菌，硫化叶菌属菌株 7 的呼吸复合体 II：基因和蛋白质”黄素和黄素蛋白 1999. 779-781 (1999)

Iwasaki,T. 他: "Spectroscopic investigation of the selective cluster conversion of archaeal zinc-containing ferredoxin from Sulfolobus sp.strain 7"J.Biol.Chem.. 275. 25391-25401 (2000)

Iwasaki, T. 等人：“来自硫化叶菌 sp.strain 7 的古菌含锌铁氧还蛋白选择性簇转化的光谱研究”J.Biol.Chem.. 275. 25391-25401 (2000)

Ishii,M.,Takishita,S.,Iwasaki,T. 他: "Purification and characterization of membrane-bound hydrogenase from Hydrogenobacter thermophilus strain TK-6, an obligately autotrophic, thermophilic, hydrogen-oxidizing bacterium."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64. 492-

Ishii, M.、Takishita, S.、Iwasaki, T. 等人：“来自嗜热氢杆菌菌株 TK-6（一种专性自养、嗜热、氢氧化细菌）的膜结合氢化酶的纯化和表征。”Biosci.Biotechnol .生物化学.. 64. 492-

Cosper, N. J.: "Structural conservation of the isolated zinc site in archaeal zinc-containing ferredoxins as revealed by X-ray absorption spectroscopic analysis and its evolutionary implications"J. Biol. Chem.. 274. 23160-23168 (1999)

Cosper, N. J.：“通过 X 射线吸收光谱分析揭示古菌含锌铁氧还蛋白中孤立锌位点的结构保守性及其进化意义”J.