一酸化窒素合成酵素(複合ヘムフラビン蛋白質)の機能解析

一氧化氮合酶（复合血黄素蛋白）的功能分析

• 批准号: 08780599
• 负责人: 岩崎 俊雄
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780599/
• 关键词: 一酸化窒素合成酵素; ヘム; シトクロムP450

脳神経型NO合成酵素(nNOS)ヘム結合ドメインの発現:NO生成の場であるnNOSのヘム中心を分光学的により詳細に検討するため、ヘム結合ドメインをグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌で発現させる系を構築した。グルタチオン存在下、アフィニティーカラムを用いて精製したところ、ヘム中心のCO結合能には影響をあたえずに微環境が変化することを見い出し、現在さらに解析している。全ドメインを含むnNOSの発現:昆虫培養細胞および大腸菌発現系を用いてマウスnNOS遺伝子を発現させ、活性型酵素として精製することにも成功した。さらにnNOSの新規活性化/安定化物質の一つとしてリン脂質が関与していることを新たに発見したので、この系をもちいて、その効果をより詳細に解析することも可能になった。nNOS変異酵素の発現と解析:NC合成酵素ヘム結合ドメインはシトクロムP450と分光学的に類似していることが示唆されているため、まずシトクロムP450ファミリーによく保存されている機能的に重要なトレオニン残基があるかどうかを検討した。NO合成酵素ヘム結合ドメインに高度に保存されているトレオニン残基のひとつをアラニンに置換した変異体を作成し、大腸菌発現系を用いて発現させ、これが機能的でななく構造的に重要であることを示した。続いて、脳に特異的に発現されている不活性型のnNOS遺伝子オルターナティブ・スプライシング産物のヘム結合ドメインを発現させて調べたところ、還元型にするとこれが容易にシトクロムP420型になることも見い出した。これらの変異酵素および野生型nNOSについては、さらに詳細な解析を行う予定である。すなわち、本研究最大の成果は、多量のサンプルを必要とする物理化学的手法を適用して将来的にnNOS活性中心の構造を詳細に解析するための展望が開けた点にある。

The development of neuro-type NO synthase (nNOS) binding enzymes: the field of NO production, nNOS binding enzymes, and the construction of a system for the development of E. coli binding enzymes. In the presence of a microenvironment, CO binding energy in the center of a microenvironment is refined and analyzed. The whole process includes the development of nNOS: insect culture cells and Escherichia coli development systems are successfully used to develop nNOS genes, and active enzymes are successfully purified. In addition, with the new discovery that lipids are related to new activating/stabilizing substances for nNOS, it is possible to clarify this system and analyze its effects in detail. The development and analysis of nNOS isoenzymes:NC synthetic enzymes bind to P450 and P450, which are similar to those of spectroscopy. NO synthase is highly conserved in the form of a protein residue, a protein residue, a protein, a protein residue, a protein, a In addition, a specific nNOS gene was found in the inactive nNOS gene, and a specific nNOS gene was found in the inactive nNOS gene. This is the case with wild-type nNOS. The greatest achievement of this study is the application of physical and chemical methods to the detailed analysis of the structure of nNOS active centers in the future.

项目成果

岩崎俊雄,他6名: "神経型NO合成酵素alternative splicing産物nNOS 2のヘム結合ドメイン" 生体機能における金属イオンの特異的作用の分子科学. 74- (1996)

Toshio Iwasaki 等 6 人：“神经元 NO 合酶选择性剪接产物 nNOS 2 的血红素结合域”金属离子对生物功能的特定影响的分子科学 74-（1996）。

堀弘幸,岩崎俊雄,他2名: "脳神経型一酸化窒素合成酵素活性化/安定化物質の検索" 生化学. 68・7. 1009- (1996)

Hiroyuki Hori、Toshio Iwasaki 等 2 人：“寻找脑神经型一氧化氮合酶的激活/稳定物质”生物化学 68・7。

岩崎俊雄,他3名: "NO合成酵素ヘム結合ドメインとシトクロムP450とのトポロジーの比較" 生化学. 68・7. 663- (1996)

Toshio Iwasaki 等 3 人：“NO 合酶血红素结合结构域和细胞色素 P450 的拓扑结构的比较”生物化学 68・7。

堀弘幸,岩崎俊雄,他3名: "脳神経型一酸化窒素合成酵素を活性化/安定化する脂溶性物質" 生体機能における金属イオンの特異的作用の分子科学. 77- (1996)

Hiroyuki Hori、Toshio Iwasaki 等 3 人：“激活/稳定脑神经型一氧化氮合酶的脂溶性物质”金属离子对生物功能的特定影响的分子科学 77- (1996)。

IWASAKI.T.,他3名: "Heme-binding domain and the threonine mutants of mouse neuronal nitric oxide synthase" Journal of Inorganic Chemistry. (印刷中). (1997)

IWASAKI.T. 和其他 3 人：“小鼠神经元一氧化氮合酶的血红素结合域和苏氨酸突变体”无机化学杂志（1997 年）。