一酸化窒素合成酵素(複合ヘムフラビン蛋白質)の機能解析

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脳神経型NO合成酵素(nNOS)ヘム結合ドメインの発現:NO生成の場であるnNOSのヘム中心を分光学的により詳細に検討するため、ヘム結合ドメインをグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌で発現させる系を構築した。グルタチオン存在下、アフィニティーカラムを用いて精製したところ、ヘム中心のCO結合能には影響をあたえずに微環境が変化することを見い出し、現在さらに解析している。全ドメインを含むnNOSの発現:昆虫培養細胞および大腸菌発現系を用いてマウスnNOS遺伝子を発現させ、活性型酵素として精製することにも成功した。さらにnNOSの新規活性化/安定化物質の一つとしてリン脂質が関与していることを新たに発見したので、この系をもちいて、その効果をより詳細に解析することも可能になった。nNOS変異酵素の発現と解析:NC合成酵素ヘム結合ドメインはシトクロムP450と分光学的に類似していることが示唆されているため、まずシトクロムP450ファミリーによく保存されている機能的に重要なトレオニン残基があるかどうかを検討した。NO合成酵素ヘム結合ドメインに高度に保存されているトレオニン残基のひとつをアラニンに置換した変異体を作成し、大腸菌発現系を用いて発現させ、これが機能的でななく構造的に重要であることを示した。続いて、脳に特異的に発現されている不活性型のnNOS遺伝子オルターナティブ・スプライシング産物のヘム結合ドメインを発現させて調べたところ、還元型にするとこれが容易にシトクロムP420型になることも見い出した。これらの変異酵素および野生型nNOSについては、さらに詳細な解析を行う予定である。すなわち、本研究最大の成果は、多量のサンプルを必要とする物理化学的手法を適用して将来的にnNOS活性中心の構造を詳細に解析するための展望が開けた点にある。