ナトリウムイオン駆動型回転モーターの単一力発生ユニットの機能解析

Vibrio alginolyticusの極毛モーターはNa^+駆動型であり、その回転には、PomA、PomB、MotX、MotYの4つのコンポーネントが必須である。べん毛モーターの機能を理解する上で、その回転速度を解析することは重要で、モーターの回転速度測定方法の1つとして、テザードセル法がある。高い時間分解能をもつ高速度CCDカメラを使用しテザードセルを解析するシステムの構築し、測定を行っている。300mM NaClで、秒速約20回のスピードで菌体が回転すると測定されていたが、それ以上の回転スピードで回ってる場合も観測され条件の厳密な検討が必要とされることが分かった。pomA欠損株中でPomAの発現量を順次増加させ、テザードセルの回転数を測定すると、時間とともに回転数が増加していくようすがみられた。一匹の菌体を継続して測定しようと試みたが、その回転している菌を見つけだすことが非常に困難であった。長時間スライドガラスとカバーガラスで挟んだ状態にしておくと、べん毛が回転しなくなるようであった。そこで、プラスチックシャーレをスライドガラスの代わりに用いてみると、長時間回転が阻害されずに維持されることが判明した。IPTGを添加し誘導したあと、顕微鏡下で観察を連続的に行い、約1時間で遊泳速度が最大になった。この条件下でテザードセルの作成を試みたが、頻度が低く、動き出すものを見つけることはやはり非常に困難であった。pYA301-A172Cプラスミドには、PomAの172番目のアラニンがシステインに置換されて変異体が乗っている。この変異体は、還元剤がない条件では、ほとんど運動できないけれども、DTTを加えることで運動性が回復する。この菌体を用いて、動いている状態から、酸化剤を加えることで停止する条件を検討している。また、キャピラリーセル中でテザードセルを効率良く作成し、培地またはバッファーを循環することができるような系を開発中である。

Vibrio alginolyticusの極毛モーターはNa^+駆動型であり、その回転には、PomA、PomB、MotX、MotYの4つのコンポーネントが必須である。べん毛モーターの機能を理解する上で、その回転速度を解析することは重要で、モーターの回転速度測定方法の1つとして、テザードセル法がある。高い時間分解能をもつ高速度CCDカメラを使用しテザードセルを解析するシステムの構築し、測定を行っている。300mM NaClで、秒速約20回のスピードで菌体が回転すると測定されていたが、それ以上の回転スピードで回ってる場合も観測され条件の厳密な検討が必要とされることが分かった。pomA欠損株中でPomAの発現量を順次増加させ、テザードセルの回転数を測定すると、時間とともに回転数が増加していくようすがみられた。一匹の菌体を継続して測定しようと試みたが、その回転している菌を見つけだすことが非常に困難であった。長時間スライドガラスとカバーガラスで挟んだ状態にしておくと、べん毛が回転しなくなるようであった。そこで、プラスチックシャーレをスライドガラスの代わりに用いてみると、長時間回転が阻害されずに維持されることが判明した。IPTGを添加し誘導したあと、顕微鏡下で観察を連続的に行い、約1時間で遊泳速度が最大になった。この条件下でテザードセルの作成を試みたが、頻度が低く、動き出すものを見つけることはやはり非常に困難であった。pYA301-A172Cプラスミドには、PomAの172番目のアラニンがシステインに置換されて変異体が乗っている。この変異体は、還元剤がない条件では、ほとんど運動できないけれども、DTTを加えることで運動性が回復する。この菌体を用いて、動いている状態から、酸化剤を加えることで停止する条件を検討している。また、キャピラリーセル中でテザードセルを効率良く作成し、培地またはバッファーを循環することができるような系を開発中である。